淋巴細(xì)胞HIV-1輔受體的表型剔除對(duì)病毒感染的阻斷作用.pdf

1、該研究課題在單一配基表達(dá)阻斷HIV-1研究的基礎(chǔ)上,采用細(xì)胞內(nèi)趨化因子(intrakine)技術(shù)構(gòu)建含有HIV-1兩類輔受體的配體——趨化因子RANTES和SDF-1的雙表達(dá)真核載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體;將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染各類細(xì)胞,觀察目的基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)與輔受體的結(jié)合;病毒感染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)輔受體表型剔除對(duì)HIV-1膜蛋白誘導(dǎo)合胞體形成、假病毒HIV-CAT的表達(dá)及病毒p24抗原活性,以觀察淋巴細(xì)胞輔受體的表型剔除對(duì)HIV-1病毒感染的

2、阻斷作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、酶切和測(cè)序表明HIV-1輔受體CCR5、CXCR4的配體RANTES和SDF-1的雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)質(zhì)粒pCMV-R-K-S-K符合其物理圖譜,構(gòu)建是成功的;將pCMV-R-K-S-K質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,間接免疫熒光和放射免疫沉淀檢測(cè)證實(shí)RANTES和SDF-1蛋白可以表達(dá)于人宮頸癌HeLa細(xì)胞系內(nèi).2、pCMV-R-K-S-K轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞可以顯著抑制M及T嗜性HIV-1膜蛋白誘導(dǎo)的合胞體形成;當(dāng)兩種嗜性

3、重組病毒感染pCMV-R-K-S-K轉(zhuǎn)化的PM-1淋巴細(xì)胞時(shí),僅檢測(cè)到背景水平的CAT活性,表明pCMV-R-K-S-K轉(zhuǎn)染可以抑制M和T嗜性HIV-1病毒的復(fù)制.3、構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-R-K-S-K(ΔNGFR),并經(jīng)酶切和測(cè)序證實(shí);pLNCX-R-K-S-K(ΔNGFR)在包裝細(xì)胞Bing的輔助與互補(bǔ)作用后,可以分泌僅有一次性感染整合作用的缺陷型病毒顆粒;SDF-1和RANTES基因通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的介導(dǎo)能穩(wěn)定地

4、整合至成纖維細(xì)胞染色體上,并有效地轉(zhuǎn)錄表達(dá).4、pLNCX-R-K-S-K(ΔNGFR)的逆轉(zhuǎn)錄病毒液感染正常人PBLs,抗-NGFR/免疫磁珠法篩選轉(zhuǎn)化成功的PBLs,用10<'3> TCID<,50>的HIV-1 DP1病毒液攻擊轉(zhuǎn)化PBLs,發(fā)現(xiàn)pLNCX-R-K-S-K(ΔNGFR)轉(zhuǎn)化PBLs可以抑制DP1膜蛋白誘導(dǎo)的合胞體形成,pLNCX-R-K-S-K(ΔNGFR)轉(zhuǎn)染在感染后第4、7和10天皆可發(fā)現(xiàn)顯著的DP1 p24抗

5、原分泌抑制(P<0.01),抗原抑制率分別為15 ﹪、43 ﹪和19 ﹪,表明pLNCX-R-K-S-K(ΔNGFR)轉(zhuǎn)染具有阻斷HIV-1 DP1病毒復(fù)制的作用.綜上所述,該文在單一輔受體表型剔除阻斷HIV-1感染研究的基礎(chǔ)上,采用細(xì)胞內(nèi)趨化因子技術(shù)進(jìn)行HIV-1兩類主要輔受體CCR5和CXCR4的配體——RANTES和SDF-1的雙表達(dá),使兩類HIV-1輔受體同時(shí)被阻斷,實(shí)現(xiàn)了廣泛抑制各種HIV-1毒株感染的目的,為將細(xì)胞內(nèi)趨化因子