胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在呼吸道合胞病毒感染誘發(fā)哮喘加重中的作用研究.pdf

1、研究背景及意義： 支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性呼吸道疾病，以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道反應(yīng)性增高及氣道重塑為主要特征。哮喘的發(fā)生與發(fā)展受多種因素的調(diào)控，從而決定了淋巴細(xì)胞分化，免疫反應(yīng)類(lèi)型，細(xì)胞因子合成及組織修復(fù)過(guò)程。盡管哮喘基礎(chǔ)研究取得較大的進(jìn)步，但目前臨床上對(duì)于哮喘的急性加重以及重癥哮喘的治療仍然不是很滿(mǎn)意。隨著分子病毒學(xué)技術(shù)的發(fā)展和RT-PCR技術(shù)在臨床研究中的應(yīng)用，呼吸道病毒感染作為哮喘加重的

2、最重要原因已被廣泛認(rèn)識(shí)。已經(jīng)證實(shí)，病毒誘發(fā)的哮喘加重在學(xué)齡兒童中的比例約為80%-85%，而在成人中約為60%-75%。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）作為呼吸道單鏈RNA病毒的一種，是引起小兒呼吸道感染的最常見(jiàn)病原體，也是誘發(fā)嬰幼兒哮喘的主要原因，在哮喘的發(fā)展和加重中被認(rèn)為是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因子。而且，針對(duì)RSV的免疫是不完全的和暫時(shí)的，所以已經(jīng)感染過(guò)RSV的成人可以再次被同株的RSV感染

3、。 微生物感染對(duì)機(jī)體的破壞作用導(dǎo)致宿主防御機(jī)制的進(jìn)化。在哺乳動(dòng)物，有兩套防御機(jī)制：固有免疫和繼發(fā)性免疫。固有免疫識(shí)別是通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）來(lái)完成的，每個(gè)受體都對(duì)微生物的保守和不變的特征識(shí)別具有廣泛的特殊性。PRRs識(shí)別微生物是通過(guò)與病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的結(jié)合來(lái)完成的。在PR

4、Rs的病毒識(shí)別中，最具特征性的是Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）。 呼吸道上皮細(xì)胞除了作為物理屏障，也能通過(guò)感受外界刺激因素啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而影響繼發(fā)性免疫反應(yīng)。在針對(duì)吸入性外來(lái)變應(yīng)原和病原體的繼發(fā)性免疫反應(yīng)的起始中，局部浸潤(rùn)的樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）起到關(guān)鍵性作用。氣道上皮細(xì)胞影響DCs可以通過(guò)DCs激活因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic st

5、romal lymphopoietin，TSLP）的產(chǎn)生來(lái)調(diào)控Th細(xì)胞的局部分化。研究證實(shí)TSLP能誘導(dǎo)DCs調(diào)節(jié)初始CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α等細(xì)胞因子。在對(duì)氣道上皮細(xì)胞生成TSLP的刺激因子的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR3的配體雙鏈RNA （dsRNA）與TLR3受體結(jié)合產(chǎn)生大量的TSLP mRNA。這提示病毒在呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中形成的dsRNA中間體，可能通過(guò)TSLP的誘導(dǎo)，加

6、重Th2炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步加重哮喘患者氣道粘膜炎癥。這個(gè)推論可以解釋為什么呼吸道病毒感染加重變態(tài)反應(yīng)性炎癥，而從免疫學(xué)理論上講，病毒誘導(dǎo)的Th1免疫反應(yīng)能拮抗Th2調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)。本項(xiàng)研究主要通過(guò)研究RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞16HBE分析固有免疫反應(yīng)受體TLR3的表達(dá)情況及對(duì)TSLP生成的影響，通過(guò)TLR3抗體阻斷的方法研究是否可以引起TSLP的生成的改變，通過(guò)模擬氣道局部Th1和Th2內(nèi)環(huán)境加入IFN-γ和IL-4觀(guān)察其對(duì)RSV感

7、染誘發(fā)的TSLP生成影響，同時(shí)觀(guān)察利巴韋林和地塞米松等藥物干預(yù)對(duì)支氣管上皮細(xì)胞生成TSLP的影響。為明確TSLP在哮喘動(dòng)物體內(nèi)的變化與哮喘的關(guān)系，通過(guò)RSV感染小鼠哮喘加重模型進(jìn)一步分析在RSV感染情況下小鼠氣道局部TSLP的表達(dá)與小鼠肺部炎癥的相互關(guān)系，并觀(guān)察不同藥物治療對(duì)RSV感染哮喘加重小鼠氣道TSLP生成和肺部炎癥的影響。 方法： 一、體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)。 1.不同濃度和不同時(shí)間人工合成dsRNA聚肌胞（Po

8、ly I：C）對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE表達(dá)TSLP mRNA和TLR3 mRNA的影響。 分別加入含0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml聚肌胞的10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，刺激3小時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)TSLP mRNA和TLR3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。 10μg/ml聚肌胞加入10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，分別刺激1h、2h、3h、6

9、h、12 h、24 h，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)TSLP mRNA和TLR3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。 2.RSV病毒感染對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE固有免疫受體TLR3表達(dá)的影響。 RSV病毒感染Hep-2細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；RSV在Hep-2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)擴(kuò)增的間接免疫熒光鑒定； Reed-Muench法測(cè)算RSV細(xì)胞毒力。RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞16HBE 24小時(shí)，間接免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞TLR3受體表達(dá)變化。

10、3.RSV病毒感染及干預(yù)因素對(duì)16HBE細(xì)胞TSLP mRNA和TLR 3mRNA表達(dá)水平和TSLP蛋白表達(dá)的影響。 試驗(yàn)分6組：對(duì)照組，RSV組，RSV/Anti-TLR3組，RSV/IFN-γ組，RSV/IL-4組，RSV/地塞米松組；RSV感染6小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TSLP mRNA和TLR3 mRNA相對(duì)表達(dá)量；RSV感染24小時(shí)后western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞TSLP蛋白表達(dá)水平。

11、 4.利巴韋林抑制RSV病毒感染對(duì)16HBE細(xì)胞TSLP mRNA表達(dá)水平和TSLP蛋白表達(dá)的影響。 試驗(yàn)分4組：對(duì)照組，RSV組，RSV/利巴韋林組，利巴韋林組；RSV感染6小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量；RSV感染24小時(shí)后western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞TSLP蛋白表達(dá)水平。 二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 1.RSV病毒感染對(duì)哮喘加重小鼠氣道TSLP分泌和肺部炎癥的影響

12、 32只BALB/c小鼠分為4組：A組（對(duì)照組），B組（OVA組），C組（RSV組），D組（OVA/RSV模型組）。 無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性：不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)，BUXCO無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)Penh值。 小鼠血清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子：小鼠血清用于IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13細(xì)胞因子檢測(cè)。 小鼠氣管灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)和ELISA檢測(cè)TSLP：聚乙烯導(dǎo)管行小鼠氣管插管，PBS灌洗，

13、灌洗液上清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子TSLP；灌洗液離心沉淀細(xì)胞計(jì)數(shù)，瑞氏-吉姆薩染色細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。 小鼠肺臟組織病理觀(guān)察：蘇木素-伊紅（HE）染色觀(guān)察小鼠肺臟病理變化；碘酸雪夫（PAS）染色觀(guān)察氣道上皮細(xì)胞粘液合成。 小鼠肺臟組織免疫組化觀(guān)察氣道上皮細(xì)胞TSLP表達(dá)，DAB顯色，陽(yáng)性顯示棕黃色。 小鼠肺臟組織TSLP蛋白western blotting檢測(cè)，Gel-Pro ANALYZER4.5軟件分析TSLP的

14、相對(duì)表達(dá)量。 2.不同藥物治療對(duì)RSV感染哮喘加重小鼠TSLP分泌和肺部炎癥的作用 32只BALB/c小鼠分為4組：對(duì)照組（OVA/RSV組），聚肌胞組（OVA/RSV/Poly I：C組），利巴韋林組（OVA/RSV/Rib組），地塞米松組（OVA/RSV/Dex組）。 無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性；小鼠血清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子血清IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13濃度；小鼠氣管灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)和

15、ELISA檢測(cè)氣管灌洗液TSLP濃度；小鼠肺臟組織病理觀(guān)察；小鼠肺臟組織免疫組化觀(guān)察TSLP表達(dá)；小鼠肺臟組織TSLP蛋白western blotting檢測(cè)。（方法同上）。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。各組間多重比較采用單向方差分析（one-way ANOVA），方差齊性時(shí)采用LSD法和SNK法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett' s T3法檢驗(yàn)。以P<

16、0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.dsRNA可以激活人支氣管上皮細(xì)胞16HBE固有免疫受體TLR3，促進(jìn)TSLPmRNA表達(dá)量增加。 2.RSV感染后病毒復(fù)制促進(jìn)固有免疫受體TLR3在人支氣管上皮細(xì)胞16HBE內(nèi)的表達(dá)。 3.RSV感染促進(jìn)16HBE細(xì)胞表達(dá)TSLP；IFN-γ可起到抑制作用，IL-4則起到協(xié)同作用促進(jìn)TSLP表達(dá)，表明不同Th1/Th2微環(huán)境對(duì)TSLP的表達(dá)有不同影響；TLR3受體阻

17、斷可以適度抑制TSLP表達(dá)，間接表明固有免疫受體TLR3在RSV感染的TSLP表達(dá)中起到一定作用；地塞米松可以顯著降低RSV感染引起的TSLP表達(dá)，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素在RSV感染引起的TSLP表達(dá)中起到抑制作用。 4.利巴韋林抗病毒治療可以有效抑制16HBE細(xì)胞表達(dá)TSLP，說(shuō)明抑制RSV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制可以起到減少細(xì)胞表達(dá)TSLP的作用。 5.RSV感染可以促進(jìn)OVA過(guò)敏性哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞生成TSLP增加，并加重肺部炎癥反