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文檔簡介
1、目的:
流行性感冒病毒(influenza virus)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae),分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常常感染人并導致嚴重疾病,在人群中迅速傳播,成為威脅人類健康的常見病原體之一。由于流感病毒是分節(jié)段的RNA病毒,容易發(fā)生錯配的RNA依賴的RNA聚合酶和基因重組導致抗原漂移和抗原轉換,尤其是表面糖蛋白抗原—血凝素(hemagglutinin, HA)最易發(fā)生變異,使流感在人群中不斷形成
2、流行。2009年A/H1N1型流感的爆發(fā)再次引起全球的關注。目前使用的抗流感疫苗只含幾種常見流行株,主要是誘導機體產生HA特異性中和抗體,只對所含型別有效,對預防變異株感染無效。世界衛(wèi)生組織根據(jù)每年流感流行情況,對疫苗組合進行調整,而疫苗的研制常常滯后于流感病毒抗原的變異。所以,研發(fā)可以抵御所有流感病毒感染,減輕感染的嚴重性并且在爆發(fā)時限制疾病的傳播的“通用型”疫苗成為對科學界的挑戰(zhàn)。
流感病毒感染誘導產生以系統(tǒng)和局部抗體
3、反應為代表的特異性體液免疫以及以特異性T細胞反應為代表的細胞免疫,二者對宿主抗病毒感染都很重要。因為針對疫苗產生的特異性抗體,不能阻止已發(fā)生變異的流感病毒感染,研究人員開始考慮能否通過提高細胞免疫的方法,達到預防異型流感病毒感染的目的。哪種細胞免疫反應在抗異型流感病毒免疫中起主要作用?其機制是什么?目前無統(tǒng)一的結論。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),異型流感病毒間存在部分交叉保護作用,而且IL-2可以提高異型流感病毒感染組的生存率。為探討其機制,本
4、研究重點研究異型流感病毒感染后T淋巴細胞增殖活性和IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細胞水平的變化。本實驗分為兩部分,一部分研究將同型和異型流感病毒感染小鼠進行比較研究;另一部分,將應用IL-2及未應用IL-2的異型流感病毒感染小鼠進行比較研究。希望能為制備“通用型”流感疫苗奠定基礎。
方法:
一、病毒滴度測定
將A/FM/47(H1N1)流感病毒株的病毒儲存液用PBS溶液進行10倍等比稀釋(1
5、0-1-10-10),把各稀釋液分別接種于9日齡雞胚尿囊腔中,33-35℃孵箱培養(yǎng),根據(jù)Reed-Muench方法,計算雞胚半數(shù)感染量。
二、動物分組
雌性,6-8周齡C57BL/6小鼠隨機分成實驗組和對照組
(1)異型流感病毒感染研究
實驗1組(同型免疫組):用A/H1N1型流感病毒免疫,A/H1N1型流感病毒感染;實驗2組(異型免疫組):用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫,A/H
6、1N1型流感病毒感染;對照1組(未免疫感染對照組):用PBS代替疫苗,A/H1N1型流感病毒感染;對照2組(空白對照組):正常飼養(yǎng),不做任何處置。
(2)應用IL-2后異型流感病毒感染研究
實驗1組(異型免疫組):用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫,A/H1N1型流感病毒感染;實驗2組(異型免疫加強組):用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫,同時使用IL-2,最后進行A/H1N1型流感病毒感染;對照1組(單純使用I
7、L-2組):只用IL-2后感染A/H1N1型流感病毒;對照2組(未免疫感染對照組):用PBS代替疫苗,感染A/H1N1型流感病毒;對照3組(空白對照組):正常飼養(yǎng),不做任何處置。
三、免疫動物、
用A/H1N1流感病毒或A/H5N1型流感病毒疫苗按上述分組參照文獻和說明書免疫動物。使用IL-2組,免疫的同時連續(xù)注射IL-2,0、1、2天。首次免疫三周后加強免疫一次,方法劑量同上。
四、感染動物<
8、br> 加強免疫兩周后,按上述分組每只小鼠經鼻腔感染A/H1N1型流感病毒。正常飲食飲水飼養(yǎng),感染病毒后每天準確稱量小鼠體重,觀察飲食飲水及精神狀態(tài)。
五、MTT法測定T淋巴細胞增殖活性
分別在感染前、感染后5天、7天取小鼠脾細胞,接種于96孔板,每個樣本做3個復孔,每板設置空白對照,濕潤環(huán)境下,37℃,5%CO,孵育68小時后進行MTT實驗,570nm讀取A值。
六、IFN-γ陽性CD3
9、+CD8+淋巴細胞的測定
分別于感染前、感染后5天、7天、14天取小鼠脾細胞。用CD3e-PerCP、CD8a-PE進行表面染色,然后向細胞懸液中加入IFN-γ-FITC進行胞內染色,最后在流式細胞儀上讀取數(shù)據(jù)。
七、統(tǒng)計學分析
用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析,以P<0.05為統(tǒng)計學差異顯著。
結果:
一、感染病毒滴度測定根據(jù)Reed-Muench方法,計算EID50
10、為104.8
二、異型流感病毒感染研究
①T淋巴細胞增殖活性
1、實驗1組(同型免疫組)和實驗2組(異型免疫組)T淋巴細胞增殖活性在感染后5天、7天都高于對照1組(未免疫感染對照組),差別顯著(P<0.05);但是實驗1組(同型免疫組)與實驗2組(異型免疫組)差別不顯著。
2、實驗1組(同型免疫組)感染后7天的T淋巴細胞增殖活性高于感染前,(P<0.05)。實驗2組(異型免疫組)感
11、染后5天、7天的T淋巴細胞增殖活性均高于感染前,且差異顯著(P<0.05);同時,感染后7天的T淋巴細胞增殖活性高于感染后5天的,差異顯著(P<0.05)。
②IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細胞的測定
(1)實驗2組(異型免疫組)IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細胞的水平在感染后7天高于實驗1組(同型免疫組),差別顯著(P<0.05)。實驗2組(異型免疫組)與對照1組(未免疫感染對照組)差別顯著(P<0
12、.05)。
(2)實驗2組(異型免疫組)IFN-γ陽性CD3℃D8+淋巴細胞的水平在感染后7天出現(xiàn)一個高峰值,與感染前和感染后5天、14天差別顯著(P<0.05)。
三、應用IL-2后異型流感病毒感染研究
①T淋巴細胞增殖活性
(1)實驗1組(異型免疫組)和實驗2組(異型免疫加強組)在感染后T淋巴細胞增殖活性增強;實驗1組(異型免疫組)與對照1組(單純IL-2免疫組)、對照2組(未
13、免疫感染對照組)差別顯著(P<0.05)。實驗2組(異型免疫加強組)與對照2組(未免疫感染對照組)差別顯著(P<0.05)。
(2)實驗1組(異型免疫組)感染后5天T淋巴細胞增殖活性較比感染前高(P<0.05),感染后7天繼續(xù)升高,與感染前和感染后5天均差別顯著(P<0.05)。實驗2組(異型免疫加強組)趨勢與實驗1組相似。
②IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細胞的測定
(1)實驗1組(異型免
14、疫組)和實驗2組(異型免疫加強組)在感染后7天IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細胞的水平均出現(xiàn)峰值。實驗2組(異型免疫加強組)與實驗1組差別顯著(P<0.05),與對照1組(單純IL-2免疫組)、對照2組(未免疫感染對照組)差別顯著(P<0.05)。
(2))實驗1組(異型免疫組)和實驗2組(異型免疫加強組)IFN-γ陽性CD3+CD8+淋巴細胞的水平在感染后7天出現(xiàn)一個高峰值,與感染前和感染后5天、14天差別顯著(P<
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