骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)材料研制及修復(fù)功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 關(guān)節(jié)骨軟骨由軟骨，軟骨下骨及之間的連接結(jié)構(gòu)構(gòu)成。人體關(guān)節(jié)活動(dòng)使用量巨大，極容易在創(chuàng)傷、腫瘤及急慢性炎癥中導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨或骨軟骨損傷。軟骨損傷也常會(huì)發(fā)展致滑膜、關(guān)節(jié)囊及軟骨下骨，導(dǎo)致骨軟骨損傷，骨軟骨損傷通常伴隨關(guān)節(jié)機(jī)械應(yīng)力改變，如不治療會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致退行性關(guān)節(jié)炎發(fā)生，患者功能障礙及生活質(zhì)量下降。關(guān)節(jié)軟骨無(wú)血液、淋巴及神經(jīng)，僅包含單一軟骨細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞比高并且缺少局部祖細(xì)胞，關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力很差。關(guān)節(jié)軟骨下

2、骨主要對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起支撐作用，軟骨下骨損傷通常采用替代物植入治療，替代物的血管化不足將不能及時(shí)修復(fù)，大塊骨缺損將明顯影響其支撐作用。骨軟骨之間的連接結(jié)構(gòu)包含深層透明軟骨、潮線、鈣化軟骨、粘合線及上層軟骨下骨，其結(jié)構(gòu)微細(xì)并復(fù)雜，骨軟骨連接區(qū)損傷可能會(huì)影響其重要的生理功能。關(guān)節(jié)軟骨及骨軟骨損傷自身修復(fù)困難，關(guān)節(jié)骨軟骨損傷治療成為目前骨關(guān)節(jié)外科難題之一。
　　 對(duì)軟骨及骨軟骨缺損修復(fù)方法較多，較有效的方法包括采用具備軟骨、軟骨下骨及其間

3、的連接結(jié)構(gòu)的自體及異體骨軟骨移植；而僅對(duì)軟骨的修復(fù)較具潛力的方法主要是組織工程技術(shù)，其中MACI(基質(zhì)介導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植)技術(shù)能達(dá)到部分透明軟骨修復(fù)效果，顯示較好的前景。MACI對(duì)骨軟骨損傷修復(fù)欠佳，而骨軟骨移植物來(lái)源有限，但MACI及骨軟骨技術(shù)提示帶軟骨、軟骨下骨及其間的連接結(jié)構(gòu)的骨軟骨單元移植并結(jié)合種子細(xì)胞可能是骨軟骨修復(fù)的潛在方案。理想的體外構(gòu)建的組織工程替代結(jié)構(gòu)應(yīng)該模擬關(guān)節(jié)組織的自然成分及結(jié)構(gòu)進(jìn)而恢復(fù)其正常功能，國(guó)內(nèi)外對(duì)組織工

4、程骨軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建研究，從“分層構(gòu)建”的可行性初探到“一體構(gòu)建”的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究取得了階段性成果，然而目前尚存在缺損區(qū)修復(fù)組織質(zhì)量缺陷、與宿主界面整合欠佳及缺乏相應(yīng)力學(xué)功能等主要問(wèn)題。由于骨及軟骨脫細(xì)胞在技術(shù)上取得一定進(jìn)展，通過(guò)粉碎軟骨并采用脫細(xì)胞試劑處理的方法可以將細(xì)胞成分去除，而保留軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分。
　　 本課題擬在此基礎(chǔ)上，分別將含骨軟骨之間連接結(jié)構(gòu)的組織及軟骨進(jìn)行脫細(xì)胞，利用脫細(xì)胞基質(zhì)材料制備含生物來(lái)源骨軟骨連接結(jié)

5、構(gòu)的骨軟骨支架材料。該支架包含深層透明軟骨、潮線、鈣化軟骨層、粘合線、軟骨下骨板等生理骨軟骨連接結(jié)構(gòu)，軟骨側(cè)構(gòu)建軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)支架，保留脫細(xì)胞軟骨下骨，盡量模擬了骨軟骨結(jié)構(gòu)。通過(guò)體外接種骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞-材料復(fù)合體，植入體內(nèi)修復(fù)動(dòng)物骨軟骨缺損模型并觀察軟骨生成效果；并且采用骨髓來(lái)源分離擴(kuò)增的內(nèi)皮祖細(xì)胞接種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料修復(fù)動(dòng)物大段骨缺損，通過(guò)血管化來(lái)促進(jìn)大段骨缺損的修復(fù)，為研究軟骨下骨缺損修復(fù)提供新的方法。本研究將為仿生制

6、備骨軟骨復(fù)合支架材料提供依據(jù)，同時(shí)為構(gòu)建更為復(fù)雜的組織工程關(guān)節(jié)創(chuàng)造條件。在研究?jī)?nèi)容上主要包括：(1)分別將軟骨粉、軟骨片及骨軟骨復(fù)合組織脫細(xì)胞處理并鑒定；(2)構(gòu)建含骨軟骨連接結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞骨軟骨復(fù)合組織工程支架；(3)利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合含骨軟骨連接結(jié)構(gòu)的骨軟骨支架修復(fù)羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)骨軟骨缺損模型；(4)采用脫細(xì)胞骨基質(zhì)接種骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)兔尺骨大段骨缺損。
　　 方法：
　　 1.將天然人軟骨在蛋白酶抑制劑保

7、護(hù)下粉碎，采用離心分選軟骨微粒，經(jīng)過(guò)軟骨脫細(xì)胞處理后制備軟骨脫細(xì)胞微粒懸液，行組織學(xué)及生化定量分析檢測(cè)。
　　 2.制備直徑為8mm含骨軟骨連接結(jié)構(gòu)的骨軟骨組織塊，其軟骨側(cè)僅保留約100μm透明軟骨，經(jīng)脫細(xì)胞處理后予組織學(xué)，生化定量分析檢測(cè)。采用凍干法及化學(xué)交聯(lián)法制備含骨軟骨連接結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞骨軟骨支架，培養(yǎng)羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于骨軟骨支架兩側(cè)，體外培養(yǎng)7天行組織學(xué)，組織相容性和細(xì)胞毒性檢測(cè)。
　　

8、 3.制備羊負(fù)重區(qū)骨軟骨缺損模型，分空白、植入空白支架及植入細(xì)胞支架復(fù)合物3組，3月后處死動(dòng)物取標(biāo)本行大體及組織學(xué)檢測(cè)。
　　 4.構(gòu)建脫細(xì)胞骨支架及骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞復(fù)合物，制備兔尺骨缺損模型，分空白，脫細(xì)胞骨支架及細(xì)胞支架復(fù)合物3組修復(fù)兔尺骨缺損，2，4，8周處死動(dòng)物取標(biāo)本行組織學(xué)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.組織學(xué)顯示直徑100μm以內(nèi)軟骨細(xì)胞微粒通過(guò)軟骨脫細(xì)胞處理后無(wú)細(xì)胞碎片殘留，甲苯胺藍(lán)染色，番紅O及

9、二型膠原免疫組化染色成陽(yáng)性，光鏡下見(jiàn)軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)部分保留；生化定量結(jié)果表明DNA成分去除，保留大量細(xì)胞外基質(zhì)成分；
　　 2.組織學(xué)顯示含部分透明軟骨的骨軟骨組織塊脫細(xì)胞處理后無(wú)細(xì)胞碎片殘留，軟骨側(cè)甲苯胺藍(lán)染色，番紅O及二型膠原免疫組化染色成陽(yáng)性，骨軟骨連接結(jié)構(gòu)功能基本保留；生化定量結(jié)果表明DNA成分去除，保留大量細(xì)胞外基質(zhì)成分；含骨軟骨連接結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞骨軟骨支架經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)骨軟骨支架連接完好，羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)良好

10、，軟骨側(cè)番紅O及二型膠原免疫染色陽(yáng)性，電鏡及組織學(xué)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好，有細(xì)胞外基質(zhì)分泌；
　　 3.修復(fù)羊負(fù)重區(qū)骨軟骨缺損模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞支架復(fù)合修復(fù)組骨軟骨有較好修復(fù)，空白支架組軟骨下骨基本修復(fù)、軟骨側(cè)無(wú)明顯修復(fù)，空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯修復(fù)，缺損邊緣軟骨退變；
　　 4.骨髓來(lái)源干細(xì)胞能通過(guò)體外分離擴(kuò)增，接種骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架體內(nèi)修復(fù)大段骨缺損后，修復(fù)組織內(nèi)微血管密度較空白支架組高(p<0.05)，并

11、能對(duì)兔尺骨大段骨缺損進(jìn)行一定程度的修復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 粉碎的軟骨微粒、厚度100μm左右軟骨片及僅含100μm厚透明軟骨的骨軟骨組織通過(guò)脫細(xì)胞處理，均可去除組織內(nèi)細(xì)胞成分，保留大部分細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)功能；通過(guò)凍干及化學(xué)交聯(lián)可制備含骨軟骨連接結(jié)構(gòu)脫細(xì)胞骨軟骨支架，該支架軟骨側(cè)為軟骨脫細(xì)胞多孔支架，軟骨下骨側(cè)為脫細(xì)胞骨，骨軟骨連接結(jié)構(gòu)保留，該支架具備良好細(xì)胞相容性，無(wú)明顯細(xì)胞毒性；含骨軟骨連接結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞骨軟骨支架接種