NONO蛋白與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病關系的臨床研究.pdf

1、背景
　　 目前，全世界每年約有2千萬人死于急性心血管事件，其中有一半以上為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。近年來，隨著人們生活水平的提高、飲食習慣的改變以及生活壓力的增大，冠心病表現(xiàn)出年輕化、高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。故而，對其進行深入研究，以期開發(fā)早期診斷和早期治療的具體措施具有重要的科學和臨床意義。當前，尋找冠心病的早期預警指標，使其防患于未然，也成為當今冠心病領域研究的熱點。
　　 冠心病的主要病理生理學基礎

2、為冠狀動脈的粥樣硬化斑塊形成，而斑塊的穩(wěn)定性改變是急性心血管事件發(fā)生的主要原因。動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性主要依賴于細胞外基質的支持，其中最主要的成分是膠原纖維，主要分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。膠原代謝主要是由膠原的合成與降解維持相對平衡來調(diào)節(jié)的。4羥基-脯氨酸羥化酶(P4H)包括2個α亞基(P4Hα1，P4Hα2)和2個β亞基(P4Hβ1，P4Hβ2)，兩者構成四聚體，是膠原合成過程中的重要限速酶。P4H過表達將會導致膠原合成增多，而抑制了P

3、4H的產(chǎn)生，則可導致膠原代謝的不穩(wěn)定和降解。我們實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn):TNF-α通過作用于ASK1-MKK4-JNK1-NONO這條信號通路，抑制了P4Hα1的表達，從而抑制了膠原的生成;敲除NONO蛋白之后，60％以上的TNFα對P4Hα1mRNA的抑制作用消失。這表明，NONO蛋白在膠原的合成的過程中發(fā)揮著重要的作用，并有可能參與斑塊易損性的調(diào)節(jié)。
　　 本研究中，擬通過分析穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者外周

4、血中NONO蛋白的表達水平，明確該蛋白在冠心病發(fā)病過程中的作用，并進而通過分析其在不同患者的表達差異，評價其作為早期預警指標的臨床應用價值。
　　 目的
　　 (1)明確NONO蛋白在不同冠心病人群中的表達差異，以評價其作為早期預警指標的可行性。
　　 (2)明確NONO蛋白在動脈粥樣硬化斑塊易損中作用的分子機制。
　　 方法
　　 1病例資料的收集
　　 收集病人和正常人的外周靜脈血標本

5、120例，其中男性72例，女性48例。年齡年齡38～73歲，平均55歲，分成4組:正常組30例，急性心肌梗死組30例，不穩(wěn)定型心絞痛組30例，穩(wěn)定型心絞痛組30例。入選標準:正常組為經(jīng)系統(tǒng)查體和冠狀動脈CT檢查排除冠心病的正常人;冠心病患者按照世界衛(wèi)生組織WHO的冠心病的診斷標準進行分組。
　　 2血中單核細胞的分離
　　 所有患者均采集肘靜脈血10ml，入EDTA抗凝管，用等體積的淋巴細胞分離液進行分離，在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)

6、2-3個小時，顯微鏡下觀察到的貼壁細胞80％為單個核細胞。
　　 3免疫熒光染色
　　 在分離出來的單核細胞中，分別加入一抗和熒光標記二抗，在激光共聚焦下觀察NONO蛋白在細胞中的位置。
　　 4實時定量PCR技術
　　 通過RNA的提取，逆轉錄，實時定量PCR的方法檢測NONO蛋白在不同組之間mRNA水平的表達。
　　 5WesternBlot
　　 通過提取蛋白，凝膠電泳，轉膜，標記一

7、抗和二抗，顯色等步驟觀察NONO在不同組之間蛋白水平的表達。
　　 6統(tǒng)計學分析
　　 所有的數(shù)據(jù)均采用mean±SEM表示。采用SPSS13.0分析軟件，計量資料應用方差分析，三組以上均數(shù)差異有統(tǒng)計學意義時，進行兩兩比較Newman-Keuls(SNK)/q檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1一般資料:收集正常人和患者的血糖、血脂、血壓、心肌酶、吸煙情況等資料。急性心肌梗死組患者的

8、血清中心肌酶的指標均增高;四組患者的吸煙史差別無統(tǒng)計學意義;與正常組相比較，急性心梗組的甘油三酯和LDL明顯升高，不穩(wěn)定組的LDL升高，差別有統(tǒng)計學意義;急性心梗組和不穩(wěn)定心絞痛組的的收縮壓、舒張壓較正常組明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義;急性心梗組的甘油三酯水平明顯高于不穩(wěn)定組和穩(wěn)定組，急性組的LDL水平明顯高于穩(wěn)定組(P均＜0.05)。其余組間數(shù)據(jù)，差別無統(tǒng)計學意義。
　　 2免疫熒光染色:在激光共聚焦顯微鏡下觀察，正常組和疾病組

9、單核細胞的細胞核內(nèi)都有NONO蛋白的表達。
　　 3實時定量PCR檢測:與正常組相比較，疾病組NONO蛋白mRNA水平表達均有不同程度的增高，其中，不穩(wěn)定型心絞痛組NONO蛋白的mRNA水平表達增高最明顯(P＜0.01)，其次是急性心肌梗死組(P＜0.05);不穩(wěn)定型心絞痛組與穩(wěn)定型心絞痛組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其他組間mRNA表達差別無統(tǒng)計學意義。(圖3:單因素方差分析，F(xiàn)3.167，df3，75，P＜0.0

10、5)。
　　 4Western-Blot檢測:與正常組相比較，不穩(wěn)定型心絞痛組NONO蛋白的表達量明顯增高(P＜0.05)，其他組間NONO蛋白的表達差異不明顯，無統(tǒng)計學意義。(圖4:單因素方差分析，F(xiàn)3.154，df3，40，P＜0.05)。
　　 結論
　　 (1)NONO蛋白在不穩(wěn)定型心絞痛組的表達顯著增高，提示NONO蛋白可以作為心肌梗死前的預警指標。
　　 (2)NONO蛋白在不穩(wěn)定型心絞痛組和