新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 研究背景及目的神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)是多分化潛能的細(xì)胞，可分化為神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，在胚胎及成年哺乳類動(dòng)物中廣泛存在。NSC的分離培養(yǎng)是其基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的前提，本部分目的在于獲得新生大鼠NSCs，為深入研究其增殖分化奠定基礎(chǔ)。 方法從新生24h內(nèi)大鼠端腦及中腦部位分離NSC，采用體外無血清懸浮培養(yǎng)，以獲得能在體外長

2、期生存的NSC；通過單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測其自我更新能力，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NSC標(biāo)志物nestin表達(dá)及分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的能力；用細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究其生長特點(diǎn)并繪制生長曲線。 結(jié)果獲得的NSC能在體外長期生存，具有很強(qiáng)的增殖能力、自我更新能力，能分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，具有多向分化能力，表達(dá)nestin，體外傳代至10代細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增了40倍。 結(jié)論成功地從新生大鼠端腦和中腦中分離得到了能在體外長期培養(yǎng)的NSC，培養(yǎng)的NSC

3、表達(dá)nestin，有自我更新、多向分化的特點(diǎn)，通過培養(yǎng)細(xì)胞大量擴(kuò)增。 第二部分 T3、胰島素誘導(dǎo)新生大鼠神經(jīng)-T細(xì)胞定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 研究背景及目的神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞替代治療提供了細(xì)胞來源，疾病的治療需要大量特定表型和功能的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，因此，對(duì)NSC分化為某種特定表型的研究成為神經(jīng)科學(xué)研究的焦點(diǎn)。少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成髓鞘細(xì)胞，其在脫髓鞘疾病方面的治療意義越來越受到人

4、們的重視，但少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞體外培養(yǎng)都有一定困難，而NSC自然分化產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例極低。本部分目的在于在體外環(huán)境下使NSC定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，為從NSC來源得到少突膠質(zhì)細(xì)胞提供細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法在第3代NSCs無血清培養(yǎng)體系中加入T3和／或胰島素，分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組：陰性對(duì)照組(含DMEM／F12，B27，bFGF，EGF)；T3組(陰性對(duì)照組+40ng/mlT3)；胰島素組(陰性對(duì)照組+25ug／ml胰島素)

5、；聯(lián)合用藥組一(陰性對(duì)照組+40ng／mlT3、25ug／ml胰島素)；聯(lián)合用藥組二(陰性對(duì)照組+20ng／mlT3、25ug／mi胰島素)。培養(yǎng)18天后撤除培養(yǎng)液中bFGF和EGF，繼續(xù)培養(yǎng)7天后終止誘導(dǎo)。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測誘導(dǎo)中期及末期NSC分化中NG2，GalC，GFAP的表達(dá)，通過比較增殖情況、分化率、GalC陽性細(xì)胞突起長度分析不同誘導(dǎo)因素組合對(duì)NSC定向誘導(dǎo)為少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用。 結(jié)果誘導(dǎo)中期各組(除對(duì)照組)均有N