Syndecan-4在bFGF誘導人系膜細胞增殖中的表達及作用的研究.pdf

1、腎小球系膜細胞的過度增殖是許多腎臟疾病的共同病理表現(xiàn),而且常伴有細胞外基質(zhì)的增多.隨著病程的進展,嚴重影響了腎小球的濾過功能.部分病人因此進展為腎小球硬化.近年來,腎小球系膜細胞增殖相關的機制探討已經(jīng)成為腎臟領域的研究熱點.syndecan-4是一種跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,其通過胞外區(qū)的硫酸乙酰肝素鏈可結(jié)合多種生長因子或細胞外基質(zhì)成分,從而參與如生長因子信號傳導、細胞增殖等多種生物學功能.Yung S等研究了syndecan-4在腎臟

2、疾病中的表達,發(fā)現(xiàn)syndecan-4 mRNA和蛋白在增殖性腎炎上調(diào);另有研究表明系膜細胞的增殖最初出堿性成纖維生長因子(basic:fibroblast growth factor.bFGF)啟動,通過自身分泌的血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)繼續(xù)維持增殖進程,提示腎小球系膜細胞過度增殖可能與syndecan-4和bFGF的作用有關.但syndecan-4是否在bFGF誘導

3、人腎小球系膜細胞(humanmesangial cell,HMC)增殖中起到重要作用,至今國內(nèi)外尚無相關報道.因此,我們開展了以下研究: 目的：1、研究syndecan-4在人腎小球系膜細胞株上的表達及分布.2、研究bFGF刺激前后HMC中syndecan-4含量、細胞增殖及細胞外基質(zhì)的變化.3、通過RNA干涉技術下調(diào)系膜細胞syndecan-4的表達,研究其是否抑制了bFGF引起的細胞生物學效應,同時動態(tài)檢測syndecan-

4、4、PKCα基因表達,探討其與bFGF的關系,闡明syndecan-4在bFGF誘導的系膜細胞增殖中的作用. 方法： 1、應用熒光定量PCR方法檢測}tMC的syndecan-4基因含量,免疫熒光及組化在蛋白水平上了解syndecan-4在HMC細胞上的表達及分布.2、設計并合成三條syndecan-4 RNA小干擾片段(Small interference RNA,siRNA),轉(zhuǎn)染細胞后應用熒光定量PCR檢測細胞中的

5、syndecan-4基因含量,篩選最佳干擾效率的siRNA片斷.3、應用外源性bFGF刺激人腎小球系膜細胞,通過MTT檢測HMC細胞增殖的劑量-效和時-效關系,篩選最佳刺激濃度的bFGF.4、設立三個細胞組并進行相應干預,分別為:空白組(無bFGF刺激)、bFGF組(有bFGF刺激)、siRNA組(bFGF刺激前進行syndecan-4 siRNA干擾),在不同時間點用熒光定量PCR檢測三組的syndecan-4、PKCα僅含量,M1T

6、r檢測細胞增殖、ELISA檢測細胞外基質(zhì)(纖維連接蛋白FN、Ⅳ型膠原、Ⅰ型膠原). 結(jié)果：1、以DAPDH為內(nèi)參,熒光定量PCR顯示人腎小球系膜細胞株每百萬看家基因中的Syndecan-4平均含量分別為4.52E+05,免疫熒光及免疫組化提示Syndecan-4在腎小球系膜細胞漿及細胞膜上均有表達. 2、結(jié)果顯示針對人類syndecan-4 mRNA 400靶位合成的Syndecan-4siRNA2基因靜默效果最強.40

7、0位點siRNA:Sense strand:5'-GAGUGAGGAUGUGUCCAACtt-3',Antisense strand:5'-GUUGGACACAUCCUCACUCtt-3'; 3、bFGF對HMC有顯著的的促增殖作用,增殖效應總體以20ng/ml劑量組作用48h最好. 4、(1)熒光定量PCR顯示:bFGF組syndecan-4 mRNA表達12h內(nèi)短暫下降,而后隨著bFGF刺激時間的延長逐漸上升,在36

8、h達到最高峰.siRNA組HMC中syndecan-4 mRNA表達顯著下降,24h時到達最低值,隨后逐漸恢復,在24h至60h含量均顯著小于bFGF組含量,并在36h均值與bFGF組達到最大差異[(0.98±0.13)×105 VS(8.16±0.68)×105,P<0.01].syndecan-4 mRNA表達在bFGF刺激36h后顯著高于無bFGF刺激的空白組[(8.16+0.68)×105 VS(4.92±0.33)X 105,

9、P<0.01]. (2)PKCα mRNA熒光定量PCR結(jié)果表現(xiàn)出相似的變化趨勢,在轉(zhuǎn)染實驗后,bFGF組PKCα mRNA表達隨著bFGF刺激時間的延長而逐漸上升,在36h達到最高峰.siRNA組HMC中PKCα mRNA表達顯著下降,24h時到達最低值,隨后逐漸回升,在0h至48h含量均顯著小于bFGF組含量,并在36h均值與bFGF組達到最大差異[(2.23土0.11)×103 VS(8.47±0.24)×103,P<0.

10、01].PKCα mRNA表達在bFGF刺激36h后顯著高于無bFGF刺激的空白組[(8.47±0.24)×103 VS(4.68±0.32)×103,P<0.01]. (3)MTT結(jié)果顯示bFGF刺激組比空白組增殖速度加快,36h、48h、60h均與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計學差異,48h時兩組OD值均數(shù)相差最大(0.423±0.028vs 0.301±0.043,P<0.01),但siRNA阻斷后,減弱了bFGF的促增殖效應,在48h

11、siRNA組和bFGF組的均數(shù)相差最明顯(0.3304±0.013 vs 0.423±0.028,P<0.01),增殖抑制率達到22.1﹪. (4)ELISA顯示隨著bFGF作用時問的延長,HMC分泌的FN逐漸增加,在24h至72h均與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計學差異;Ⅳ型膠原在72h、96h比空白組顯著升高,syndecan-4 siRNA轉(zhuǎn)染HMC細胞后,可以顯著抑制同期FN、Ⅳ型膠原分泌.I型膠原變化無明顯差異. 結(jié)論：