蟲草素、普伐他汀對腫瘤壞死因子α誘導大鼠血管平滑肌細胞syndecan-4蛋白表達的影響.pdf

1、研究背景：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是導致心血管疾病的重要因為之一。日益增多的證據表明,動脈粥樣硬化是一個對血管損傷的過度炎癥反應。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和表型改變是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的主要病理基礎之一。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-alpha,TNF-α)是炎癥反

2、應的關鍵調節(jié)因子之一,可從多種不同的炎癥細胞中釋放,在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)類的跨膜轉運蛋白多糖syndecans家族的成員之一。Syndecan-4在多種細胞均有表達,它在非哺乳動物中的主要作用是促進神經系統(tǒng)的發(fā)育,在哺乳動物中調控著多種細胞生物學效應,在細胞的伸展、識別、粘附、遷移和增殖控制中扮演著重要的角色,同時也介導炎癥反應[1]。蟲草素(

3、cordycepin)即3’-脫氧腺苷,為含氮配糖體的核酸衍生物,為冬蟲夏草的主要藥理活性成分之一,既往的研究表明,蟲草素具有抗炎和免疫調節(jié)等作用[2];目前包括普伐他汀在內的他汀類藥物已經成為冠心病治療的基石,它通過競爭性抑制膽固醇合成的限速3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA),從而降低膽固醇的合成。然而,他汀類藥物具有不依賴于其降血脂特性的抗炎功效,能抑制許多炎癥因子的表達和降低許多血清炎癥標志物,對炎癥反應過程各

4、階段均有抑制作用[2]。
　　 目的：
　　 分別以蟲草素(cordycepin)和普伐他汀(pravastatin)為研究對象,通過體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞,了解蟲草素和普伐他汀對TNF-α誘導的大鼠胸主動脈VSMCs細胞syndecan-4蛋白表達的影響,進一步從細胞和分子水平上闡述syndecan-4蛋白在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法
　　 1.細胞增殖的檢測:
　

5、　 實驗一:應用96孔板體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs,用終濃度為20ng/mL TNF-α、20μmol/mL蟲草素、40μmol/mL蟲草素、20μmol/mL蟲草素聯(lián)用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL蟲草素聯(lián)用20ng/mL TNF-α分別作用24小時。每組濃度設6個副孔,同樣實驗條件重復6次,每組共36例實驗數據,并設立對照組進行比較,采用MTS/PMS法確定大鼠胸主動脈VSMCs的增殖狀態(tài)。
　　

6、實驗二:應用96孔板體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs,用終濃度為20ng/mL TNF-α、10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀、10μmol/mL普伐他汀聯(lián)用20ng/mL TNF-α、20μmol/mL普伐他汀聯(lián)用20ng/mL TNF-α分別作用24小時。每組濃度設13個副孔,同樣實驗條件重復2次,每組共26例實驗數據,并設立對照組進行比較,采用MTS/PMS法確定SD大鼠胸主動脈VSMCs的增殖狀態(tài)。

7、　　 2.Syndecan-4蛋白表達的檢測:
　　 實驗一:體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs,用終濃度為20ng/mL TNF-α、20μmol/mL蟲草素、40μmol/mL蟲草素、20μmol/mL蟲草素聯(lián)用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL蟲草素聯(lián)用20ng/mL TNF-α分別作用24小時,裂解細胞提取蛋白,考馬斯亮藍G-250染色法測定總蛋白濃度,利用Western blotting蛋白免疫印跡法測定大鼠

8、胸主動脈平滑肌細胞syndecan-4蛋白的表達情況。每組濃度重復實驗3次,共3例實驗數據,并設立對照組進行比較。
　　 實驗二:體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs,用終濃度為20ng/mL TNF-α、10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀、10μmol/mL普伐他汀聯(lián)用20ng/mLTNF-α、20μmol/mL普伐他汀聯(lián)用20ng/mL TNF-α分別作用24小時,裂解細胞提取蛋白,考馬斯亮藍G-250染色法測

9、定總蛋白濃度,利用Western blotting蛋白免疫印跡法測定大鼠胸主動脈平滑肌細胞syndecan-4蛋白的表達情況。每組濃度重復實驗3次,共3例實驗數據,并設立對照組進行比較。
　　 結果
　　 1、蟲草素對TNF-α誘導的大鼠VSMCs增殖的影響
　　 MTS/PMS法測定各組細胞增殖率分別為:對照組0.666±0.098,TNF-α20ng/mL組1.014±0.149,20μmol/mL蟲草素組0

10、.660±0.097,40μmol/mL蟲草素組0.676±0.085,TNF-α 20ng/mL聯(lián)用20μmol/mL蟲草素組0.662±0.107,TNF-α20ng/mL聯(lián)用40μmol/mL蟲草素組0.627±0.135。統(tǒng)計分析結果表明,與對照組比較,20ng/mL TNF-α組能顯著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05),而20μmol/mL蟲草素、40μmol/mL蟲草素組單獨應用對大鼠VSMCs的增殖均無顯著影響(P>

11、0.05)。20μmol/mL蟲草素聯(lián)用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL蟲草素聯(lián)用20ng/ml TNF-α組與20ng/mL TNF-α組比較對VSMCs增殖均有顯著的抑制作用(P<0.05)。
　　 2、蟲草素對TNF-α誘導的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表達的影響
　　 以目的蛋白對照組灰度值與內參對照組灰度值的比值為1,其余各組syndecan-4蛋白表達量分別為:TNF-α 20ng/

12、mL組1.375±0.017,20μmol/mL蟲草素組1.009±0.112,40μmol/mL蟲草素組1.002±0.051,TNF-α20ng/mL+20μmol/mL蟲草素組0.962±0.057,TNF-α 20ng/mL+40μmol/mL蟲草素0.914±0.057(如圖2)。統(tǒng)計分析表明,與對照組比較,TNF-α組能顯著刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表達(P<0.05)；而蟲草素不同劑量組單獨應用對VSMCs的

13、syndecan-4蛋白表達均無顯著作用(P>0.05)。TNF-α聯(lián)合蟲草素共同作用組與TNF-α組比較對VSMCs的syndecan-4蛋白表達均有顯著抑制作用(P<0.05)。
　　 3、普伐他汀對TNF-α誘導的大鼠VSMCs增殖的影響
　　 MTS/PMS法測定各組細胞增殖率分別為:對照組0.625±0.133,TNF-α20ng/mL組1.069±0.146,10μmol/mL普伐他汀組0.635±0.134

14、,20μmol/mL普伐他汀組0.651±0.134,TNF-α20ng/mL聯(lián)用10μmol/mL普伐他汀組0.684±0.128,TNF-α 20ng/mL聯(lián)用20μmol/mL普伐他汀組0.630±0.145。統(tǒng)計分析結果表明,與對照組比較,20ng/mL TNF-α組能顯著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05),而10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀組單獨應用對大鼠VSMCs的增殖均無顯著影響(P>0.05)

15、。10μmol/mL普伐他汀聯(lián)用20ng/mL TNF-α、20μmol/mL普伐他汀聯(lián)用20ng/ml TNF-α組與20ng/mL TNF-α組比較對VSMCs增殖均有顯著的抑制作用(P<0.05)。
　　 4、普伐他汀對TNF-α誘導的VSMCS細胞syndecan-4蛋白表達的影響
　　 以目的蛋白對照組灰度值與內參對照組灰度值的比值為1,其余各組syndecan-4蛋白表達量分別為:TNF-α20ng/mL組1

16、.340±0.050,10μmol/mL普伐他汀組1.023±0.035,20μmol/mL普伐他汀組1.010±0.072,TNF-α20ng/mL+10μmol/mL普伐他汀組0.967±0.038,TNF-α 20ng/mL+20μmol/mL普伐他汀0.923±0.038。統(tǒng)計分析表明,與對照組比較,TNF-α組能顯著刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表達(P<0.05);而普伐他汀不同劑量組單獨應用對VSMCs的synd

17、ecan-4蛋白表達均無顯著作用(P>0.05)。TNF-α聯(lián)合普伐他汀共同作用組與TNF-α組比較對VSMCs的syndecan-4蛋白表達均有顯著抑制作用(P<0.05)。
　　 結論
　　 綜上所述,本研究證明了一定劑量的蟲草素和普伐他汀能夠顯著抑制TNF-α誘導的大鼠VSMC增殖和syndecan-4蛋白表達。因此,有必要進一步研究蟲草素和普伐他汀抑制syndecan-4蛋白表達的相關潛在靶點,為動脈粥樣硬化的防