HMGB1在狼瘡性腎炎腎小球系膜細胞增殖中的作用及機制.pdf

1、目的:本研究擬以狼瘡性腎炎(lupus nephrits，LN)模型MRL/faslpr小鼠和小鼠系膜細胞為研究對象，探討高遷移率族蛋白(high mobility groupprotein B1，HMGB1)及其相關信號通路在狼瘡性腎炎腎小球系膜細胞增殖中的作用及其可能作用機制，并應用電穿孔技術進行小鼠活體轉染，觀測敲低HMGB1及其相關信號通路因子的表達對小鼠腎臟損傷和腎功能改善情況，為狼瘡性腎炎的病因研究和靶向治療提供依據(jù)。

2、>　　方法:
　　1、檢測HMGB1，PCNA和TLR2在MRL/faslpr小鼠腎組織的表達
　　28周齡雄性MRL/MPJ小鼠和MRL/faslpr小鼠（體重:45-55g）各8只，分別設為對照組（Control組）和狼瘡性腎炎組（LN組）。留取24h尿液及內(nèi)眥動脈取血后處死小鼠，取腎臟皮質，部分置于4％多聚甲醛固定，用于光鏡檢測;部分置于液氮保存，用于冰凍切片和腎小球目的蛋白及RNA水平檢測。常規(guī)病理染色技術觀察腎小球

3、形態(tài)結構;免疫熒光技術和Western blot檢測腎皮質HMGB1、PCNA和TLR2蛋白的表達;顯微切割技術提取腎小球組織，Real-time PCR檢測腎小球HMGB1、PCNA和TLR2 mRNA的表達;雷諾RT-9600半自動生化分析儀檢測Scr、BUN和24h蛋白尿生化指標。
　　2、敲低MRL/faslpr小鼠腎皮質HMGB1的表達對小鼠腎臟增殖水平及腎功能的影響
　　(1)以小鼠系膜細胞為研究對象，脂質體介導

4、向細胞內(nèi)轉染shHMGB1質粒，Western blot和Real-time PCR檢測shHMGB1質粒對小鼠系膜細胞HMGB1蛋白及mRNA表達水平的抑制作用。(2)28周齡雄性MRL/MPJ小鼠（體重:45-55g）6只設為對照組（Control組），18只等周齡等體重MRL/faslpr雄性小鼠隨機分為狼瘡性腎炎組（LN組），shNC干預組（LN+shNC組）和shHMGB1干預組（LN+shHMGB1組）。電穿孔技術向治療組小

5、鼠腎臟皮質轉染干擾質粒。2周后留取24h尿液和內(nèi)眥動脈取血后處死小鼠取腎臟皮質，部分置于4％多聚甲醛固定，用于常規(guī)形態(tài)學檢測;部分皮質置于液氮保存，用于冰凍切片和腎皮質蛋白檢測。常規(guī)病理染色技術檢測小鼠組織形態(tài)結構;免疫熒光檢測腎小球內(nèi)HMGB1和PCNA蛋白的表達;Western blot和Real-time PCR檢測腎皮質中HMGB1和PCNA蛋白及mRNA表達水平;雷諾RT-9600半自動生化分析儀檢測Scr、BUN和24h蛋白

6、尿生化指標。
　　3、檢測HMGB1對體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞增殖水平的影響及其作用機制
　　小鼠系膜細胞在37℃、5％CO2條件下，以含10％胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)。(1)為了探討HMGB1對細胞增殖的影響，將細胞分別以50μg.L-1、100μg.L-1和200μg.L-1 HMGB1刺激2、4、8和12h，并于收集細胞前1h加入10μmol.L-1 BrdU，以ELISA技術檢測小鼠系膜細胞的增殖水

7、平。(2)根據(jù)(1)的實驗結果，將MMC細胞隨機分為對照組和100μg.L-1 HMGB1刺激組，分別于刺激10min、20min、30min、40min、50min和1h時收集細胞，Western blot檢測p85、p110、p-Aktser473、Akt、p-IκBa和IBa蛋白的表達水平，免疫細胞化學檢測NF-κB p65核轉位情況。(3)細胞隨機分為Control組、HMGB1刺激組、LPS+HMGB1組和TLR2AB(blo

8、ck antibody)+LPS+HMGB1組，先后加入5μg.mL-1TLR2 AB(blockantibody)孵育1h，5μg.mL-1LPS孵育2h，100μg.L-1 HMGB1或DMSO，繼續(xù)孵育8h，并于收集細胞前1h加入10μmol.L-1 BrdU，Western blot和Real-time PCR檢測PCNA蛋白和mRNA表達情況，免疫細胞化學檢測BrdU表達情況。(4)細胞隨機分為Control組和HMGB1刺激

9、組，100μg.L-1HMGB1孵育10min，免疫共沉淀結合Western blot檢測TLR2蛋白和p85蛋白結合水平。(5)細胞隨機分為Control組，HMGB1刺激組，LY294002+HMGB1組和DMSO+HMGB1組，先后加入30μmol.L-1LY294002或DMSO孵育1h和100μg.L-1 HMGB1孵育8h，并于收集細胞前1h加入10μmol.L-1 BrdU，Western blot和免疫細胞化學檢測細胞增

10、殖水平;或先后加入或不加30μmol.L-1 LY294002孵育1h和100μg.L-1HMGB1孵育50min，免疫細胞化學檢測NF-κB p65核轉位水平。(6)細胞隨機分為Control組， HMGB1刺激組，PDTC+HMGB1組和DMSO+HMGB1組，先后加入或不加30μmol.L-1 PDTC孵育1h和100μg.L-1 HMGB1孵育8h，并于收集細胞前1h加入10μmol.L-1 BrdU，Western blot和

11、免疫細胞化學檢測細胞增殖水平;或先后加入或不加30μmol.L-1 PDTC孵育1h和100μg.L-1 HMGB1孵育30min，Western blot檢測p-Aktser473表達水平。(7)細胞隨機分為Control組和HMGB1刺激組，100μg.L-1 HMGB1孵育90min，染色質免疫共沉淀檢測NF-κB p65蛋白和CylinD1啟動子序列的結合水平。
　　4、敲低MRL/faslpr小鼠腎組織TLR2或Akt的

12、表達對小鼠腎臟增殖水平及蛋白尿水平的影響
　　(1)以小鼠系膜細胞為研究對象，脂質體介導向細胞內(nèi)轉染shTLR2或shAkt質粒，Western blot和Real-time PCR檢測質粒對小鼠系膜細胞TLR2或Akt蛋白及mRNA表達水平的抑制作用。(2)28周齡雄性MRL/MPJ小鼠（體重:45-55g）6只設為對照組（Control組），18只等周齡等體重MRL/faslpr雄性小鼠隨機分為狼瘡性腎炎組（LN組），shNC

13、干預組（LN+shNC組）組和shTLR2干預組（LN+shTLR2組）或shAkt干預組（LN+shAkt組）。電穿孔技術向治療組小鼠腎臟皮質轉染干擾質粒。2周后留取24h尿液和內(nèi)眥動脈取血后處死小鼠取腎臟皮質，部分置于4％多聚甲醛固定，用于常規(guī)病理學染色技術檢測;部分皮質置于液氮保存，用于冰凍切片和腎皮質蛋白檢測。HE染色檢測小鼠組織形態(tài)結構;免疫熒光檢測腎小球內(nèi)PCNA和TLR2或Akt蛋白的表達;Western blot和Rea

14、l-time PCR檢測腎小球中PCNA和TLR2或Akt蛋白及mRNA表達水平;雷諾RT-9600半自動生化分析儀檢測Scr、BUN、尿白蛋白生化指標。
　　結果:
　　1、HMGB1、PCNA和TLR2在MRL/faslpr小鼠腎小球的表達上調(diào)
　　(1)光鏡觀察:與Control組相比，LN組小鼠腎小球體積增大，細胞數(shù)目增多。(2)免疫熒光檢測顯示，在Control組小鼠腎小球中，HMGB1只表達于細胞核中，而在

15、LN組小鼠腎組織中HMGB1則同時表達于腎小球細胞的胞核和核外;PCNA陽性信號在Control組和LN組小鼠腎小球中都主要定位于細胞核，但在后者的表達強于前者;TLR2在Control組小鼠腎小球中無明顯表達，而在LN組腎小球中出現(xiàn)明顯的陽性表達，且陽性信號呈系膜狀呈現(xiàn)。(3)Western blot結果表明，與Control組相比，LN組小鼠腎皮質HMGB1、PCNA和TLR2蛋白的相對表達量顯著升高。(4)Real-time PC

16、R檢測結果顯示，與Control組相比，LN組小鼠腎小球HMGB1、PCNA和TLR2 mRNA的表達水平均明顯升高。(4)腎功能:與正常組相比，狼瘡組小鼠24h蛋白尿水平升高，而Scr和BUN變化不明顯。
　　2、敲低HMGB1表達有效降低MRL/faslpr小鼠腎小球增殖水平及蛋白尿水平
　　(1)shHMGB1質粒能夠有效下調(diào)小鼠系膜細胞中HMGB1蛋白及mRNA表達水平:Western blot結果顯示，與Contr

17、ol組相比，shHMGB1組小鼠系膜細胞的HMGB1蛋白的表達水平明顯降低;Real-time PCR結果顯示，shHMGB1組小鼠系膜細胞的HMGB1mRNA水平較Control組均明顯下調(diào)。(2)活體電穿孔技術可有效的將質粒轉染至小鼠腎皮質:冰凍切片熒光顯微鏡下觀察結果提示，電穿孔轉染后1天、7天和14天目的質粒在小鼠腎皮質均有熒光表達，其中第7天時表達最強，第14天表達較低。(3) shHMGB1質粒有效下調(diào)狼瘡模型小鼠HMGB1

18、蛋白和mRNA的表達:免疫熒光檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球HMGB1蛋白的表達明顯降低，且主要定位于細胞核;Western blot結果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎皮質中HMGB1蛋白的表達水平明顯降低;Real-time PCR結果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球的HMGB1 mRNA表達水平明顯降低。(4)敲低腎組織中HMGB1表達能夠降低狼瘡模型小鼠腎小球細胞增殖水

19、平:肉眼觀察，各組小鼠腎臟體積、質量均無明顯變化。光鏡下觀察，與LN組相比，LN+shHMGB1組小鼠腎小球細胞細胞數(shù)目有所減少，但仍高于Control組;免疫熒光檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球PCNA蛋白的表達明顯降低;Western blot結果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎皮質中PCNA蛋白的表達水平明顯降低;Real-timePCR結果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球

20、的PCNAmRNA表達水平明顯降低。(5)沉默腎組織中HMGB1表達能夠降低狼瘡性腎炎模型小鼠蛋白尿水平:生化檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠24h蛋白尿量出現(xiàn)明顯的降低，血肌酐和血尿素水平無明顯差別。
　　3、HMGB1通過PI3K/Akt/NF-Kb/Cylin D1信號通路上調(diào)體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞的增殖水平
　　(1)HMGB1能夠上調(diào)小鼠系膜細胞增殖水平:BrdU摻入法ELISA技術檢測結果顯示，

21、100μg.L-1HMGB1或200μg.L1HMGB1刺激2h后，系膜細胞增殖水平均逐漸升高，并于8h達到高峰，12h逐漸降低;50μg.L-1HMGB1各時間點對系膜細胞的促增殖作用均低于100μg.L-1HMGB1組;而100μg.L-1HMGB1和200μg.L-1HMGB1兩組之間HMGB1作用8h細胞增殖水平無明顯差別。(2)HMGB1的促增殖作用是TLR2依賴性的: BrdU摻入法細胞免疫熒光檢測結果顯示，與Control

22、組相比，HMGB1刺激組系膜細胞中BrdU陽性表達率明顯增高;與HMGB1刺激組相比，LPS+HMGB1組BrdU陽性細胞比例顯著增加，而TLR2中和抗體能夠降低BrdU陽性細胞比例。(3)HMGB1上調(diào)TLR2與p85蛋白的結合:免疫共沉淀結合Western blot結果提示，Control組TLR2與p85無明顯結合，HMGB1刺激5 min后，檢測到較明顯與TLR2結合的p85蛋白條帶。(4)HMGB1能夠激活小鼠系膜細胞的PI3

23、K/Akt/NF-κB信號通路:Western blot結果顯示，HMGB1刺激30min時，p-Aktser473蛋白表達水平瞬時升高，同時，p-IκBa表達水平升高，而IκBa表達開始降低;細胞免疫熒光檢測結果顯示，正常細胞NF-κBp65主要定位于細胞漿，HMGB1刺激50min后，NF-κBp65主要在細胞核表達。(5)HMGB1所介導的核轉位的NF-κBp65與Cyclin D1啟動子區(qū)域結合增強:染色質免疫共沉淀結果提示，H

24、MGB1刺激90min后，PCR檢測到明顯的與NF-κBp65結合的Cylin D1DNA。(6)LY294002和PDTC均能夠抑制HMGB1對小鼠系膜細胞的增殖作用:BrdU摻入法細胞免疫熒光檢測結果顯示，與HMGB1組相比，LY294002+HMGB1組和PDTC+HMGB1組BrdU陽性細胞比例降低，Western blot和Real-time PCR結果顯示，與HMGB1組相比，LY294002+HMGB1組和PDTC+HMG

25、B1組PCNA和Cyclin D1蛋白和mRNA表達水平降低。(7)LY294002能夠部分抑制NF-κBp65的核轉位而PDTC對Akt活化水平無明顯影響:免疫熒光結果顯示，與HMGB1組相比，LY294002+HMGB1組NF-κBp65蛋白在系膜細胞細胞核內(nèi)的表達降低，定位于胞漿和胞核。Western blot結果提示，PDTC+HMGB1組p-Aktser473表達水平與HMGB1組無明顯區(qū)別。
　　4、敲低TLR2表達有

26、效降低MRL/faslpr小鼠腎小球增殖水平及蛋白尿水平，敲低Akt則對腎小球增殖水平及蛋白尿水平無明顯影響
　　(1)shTLR2質?？捎行抡{(diào)小鼠系膜細胞和腎組織中TLR2蛋白和mRNA水平:Western blot結果顯示，與Control組相比，shTLR2組小鼠系膜細胞的TLR2蛋白的表達水平明顯降低;Real-time PCR結果顯示，shTLR2組小鼠系膜細胞的TLR2 mRNA水平明顯將低。(2) shTLR2質粒

27、能夠降低腎組織中TLR2蛋白和mRNA表達:免疫熒光檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球的TLR2的表達水平明顯降低;Western blot結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎皮質TLR2蛋白表達明顯降低;Realtime-PCR結果顯示，與LN組小鼠相比，shTLR2組小鼠腎小球的TLR2mRNA表達水平均明顯降低。(3)沉默腎組織中TLR2表達可降低腎小球細胞增殖:肉眼觀察，各組小鼠腎臟

28、體積、質量均無明顯變化。但光鏡下觀察，與LN組相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球細胞數(shù)目有所減少，但仍高于Control組;免疫熒光檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球的PCNA同樣表達于細胞核，但表達水平明顯降低;Western blot結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎皮質PCNA蛋白表達明顯降低;Realtime-PCR結果顯示，與LN組小鼠相比，shTLR2組小鼠腎小球的PCNAm

29、RNA表達水平均明顯降低。(4)沉默腎組織中TLR2表達能夠有效降低小鼠蛋白尿水平:生化檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠的24h蛋白尿量出現(xiàn)降低，血肌酐和血尿素無明顯差別。(5) shTLR2質粒對小鼠腎皮質p-Aktser473表達水平無明顯影響:免疫熒光檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球p-Aktser473蛋白表達水平無明顯變化。(6) shAkt質?？捎行抡{(diào)小鼠系膜細胞中Ak

30、t蛋白和mRNA水平:Western blot結果顯示，與Control組相比，shAkt組小鼠系膜細胞的Akt蛋白的表達水平明顯降低;Real-time PCR結果顯示，shAkt組小鼠系膜細胞的Ak tmRNA水平明顯將低。(7)shAkt質粒能夠降低腎組織中Akt蛋白和mRNA表達:免疫熒光檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠腎小球的Akt的表達水平明顯降低;Western blot結果顯示，與LN組小鼠相比，L

31、N+shAkt組小鼠腎皮質Akt蛋白表達明顯降低;Realtime-PCR結果顯示，與LN組小鼠相比，shAkt組小鼠腎小球的AktmRNA表達水平均明顯降低。(8) shAkt對小鼠腎小球增殖水平無明顯改善:肉眼觀察，各組小鼠腎臟體積，質量均無明顯變化。光鏡下觀察，LN組和LN+shAkt組小鼠腎小球形態(tài)結構無明顯改善;免疫熒光檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠腎小球的PCNA蛋白表達水平無明顯改變;Western

32、 blot結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠腎皮質PCNA蛋白表達水平無明顯改變;Realtime-PCR結果顯示，與LN組小鼠相比，shAkt組小鼠腎小球PCNAmRNA表達水平無明顯改變。(9) shAkt質粒對小鼠蛋白尿水平無明顯影響:生化檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠的24h蛋白尿量、血肌酐和血尿素均未出現(xiàn)明顯差別。
　　結論:
　　1、與正常對照組MRL/MPJ小鼠相比，狼瘡

33、性腎炎模型MRL/faslpr小鼠腎組織中HMGB1、PCNA和TLR2的表達水平明顯升高，而采用電穿孔轉染技術沉默腎組織中HMGB1和TLR2表達能夠降低腎小球細胞增殖水平和24h蛋白尿水平，提示HMGB1可能通過TLR2相關途徑上調(diào)系膜細胞增殖水平從而參與狼瘡性腎炎發(fā)生的。
　　2、HMGB1可以上調(diào)體外小鼠系膜細胞的增殖水平，TLR2參與了促增殖過程，而PI3K/Akt/NF-κB/CylinD1信號通路被激活;TLR2抑制

34、可有效的阻滯HMGB1的促增殖作用及PI3K/Akt/NF-κB/Cylin D1信號通路的活化;LY294002和PDTC均可阻滯HMGB1的促增殖作用，同時LY294002有效阻斷HMGB1引起的p65的核轉位，而PDTC對HMGB1引起的PI3K/Akt活化無明顯影響;提示HMGB1在體外通過與其受體TLR2結合激活PI3K/Akt/NF-κB/Cylin D1信號通路，推動細胞周期進程，促進系膜細胞增生。
　　3、電穿孔技