肺癌特異性DKK1基因轉錄調控元件的分析預測及活性篩選.pdf

1、DKK1是經(jīng)典 wnt信號通路的拮抗劑。它可以與 Lrp5/6受體結合,對 wnt信號通路產生競爭性抑制作用。此外DKK1還能夠與親和受體Kremen及Lrp6受體結合,誘導產生內吞作用,從而減少細胞膜表面 Lrp6受體的數(shù)量。DKK1能夠在肺癌中特異性、高水平表達。DKK1主要在胚胎組織中表達,在正常細胞中不表達。但是 DKK1在多種非小細胞細胞系、組織中均高水平表達。與其它惡性腫瘤、良性肺疾病和健康對照組相比,肺癌患者血清中 DKK

2、1濃度顯著升高,可作為肺癌診斷的一種血清標志物。
　　目前關于肺癌中 DKK1特異性高表達的調控機制研究鮮有報道。我們的研究發(fā)現(xiàn) DKK1啟動子在肺癌細胞中的活性并不是很高,說明可能存在增強子等元件調控DKK1的表達。因此DKK1增強子元件的篩選將有助于DKK1的肺癌特異性調控機制研究。
　　本研究的關鍵難點在于對 DKK1基因增強子等轉錄調控元件在基因組中的分布進行預測及定位。為此,本文將四段不同長度的 DKK1啟動子片段

3、構建到pGL3-basic載體中。我們將構建得到的重組載體轉染A549、H460、H446、Eca-109、Chang liver和 HEK293細胞,并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測不同長度DKK1啟動子片段活性,最終我們確定 DKK1-5片段活性較好,可作為 DKK1基因近端啟動子片段。然后通過 UCSC人類基因組瀏覽器獲取 A549細胞中DKK1基因位點的DNase I超敏性、組蛋白修飾等表觀遺傳信息。通過對這些信息的分析,預測得

4、到12條候選增強子元件片段。最后將候選片段分別插入到DKK1-5近端啟動子上游,成功構建了12種重組質粒。并在細胞水平上通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證相關候選元件的增強子活性。
　　本文首次獲得六段候選元件: TRE3、TRE4、TRE6、TRE7、TRE8、TRE12在A549細胞中對DKK1啟動子具有顯著增強作用。TRE3、TR4、TRE12在H460中具有顯著增強作用。且TRE3、TRE4、TRE7、TRE8對DKK1啟