B和C基因型重組乙型肝炎病毒的構(gòu)建及其相關(guān)研究.pdf

1、研究目的： 1．構(gòu)建B和C基因型重組乙型肝炎病毒及檢測(cè)其在Huh7細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和表達(dá)。 2．探討B(tài)和C基因型乙型肝炎病毒對(duì)Huh7細(xì)胞全基因組表達(dá)模式的影響是否相似。 3．評(píng)價(jià)針對(duì)重組B和C基因型HBV S區(qū)目的小發(fā)夾RNAs(shRNAs)在存在錯(cuò)配的情況下對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制作用，對(duì)HBsAg mRNA水平的抑制作用，及對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制程度。 研究方法： 1．根據(jù)相關(guān)文

2、獻(xiàn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增HBV全基因組的引物，分別從感染B和C基因型的患者血清中提取HBV DNA作為模板，應(yīng)用高保真熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶擴(kuò)增HBV全基因組； 2．SacⅠ酶切擴(kuò)增的全長(zhǎng)HBV和pUC19，應(yīng)用T4 DNA連接酶使HBV插入pUC19上的SacⅠ酶切位點(diǎn)，命名為pUC19-BHBV和pUC19-CHBV； 3．應(yīng)用SapⅠ酶切pUC19-HBV和pHY106真核表達(dá)載體，將獲得的全長(zhǎng)HBV在與線(xiàn)性的pHY106連

3、接，使全長(zhǎng)HBV插入pHY106的SapⅠ酶切位點(diǎn)，命名為pHY106-BHBV和pHY106-CHBV； 4．將pHY106-BHBV和pHY106-CHBV分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，以pHY106空載體轉(zhuǎn)染作對(duì)照；①分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h取細(xì)胞培養(yǎng)上清，-20℃凍存，用于ELISA檢測(cè)HBsAg和HBeAg表達(dá)；②轉(zhuǎn)染后72h，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)HBV核心顆粒HBV復(fù)制中間體，用于Southern blot檢測(cè)；③

4、轉(zhuǎn)染后72h，用PBS沈細(xì)胞5次，裂解細(xì)胞，應(yīng)用Real-time PCR定量檢測(cè)Huh7細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平。 5．基因芯片技術(shù)：B或C基因型重組乙型肝炎病毒(即pHY106-BHBV，pHY106-CHBV)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，以pHY106空載體為對(duì)照，48h后提取細(xì)胞mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，與芯片雜交，用GenePix Pro3.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度，計(jì)算每個(gè)基因點(diǎn)在本次實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)差異值Ra

5、tio，Ratio=Cy5/CY3；篩選出Ratio大于2或小于0.5的基因點(diǎn)，這些數(shù)據(jù)所代表的基因在與兩種探針雜交時(shí)表現(xiàn)出較大的差異； 6．實(shí)時(shí)定量PCR：pHY106-BHBV，pHY106-CHBV轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48h，以pHY106空載體為對(duì)照，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)基因芯片差異表達(dá)的部分基因進(jìn)行驗(yàn)證。 7．將shRNAs分別和B或C基因型重組HBV，即pHY106-BHBV和

6、pHY106-CHBV共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞；于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h和120h分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清，-20℃凍存，留作ELISA檢測(cè)HBsAg和HBeAg表達(dá)水平； 8．shRNAs分別和B或C基因型重組HBV轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72h后，應(yīng)用Trizol法提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR，對(duì)HBsAg mRNA水平進(jìn)行半定量檢測(cè)；于轉(zhuǎn)染后72h，裂解細(xì)胞，提取HBV核心顆粒內(nèi)的HBV復(fù)制中間體進(jìn)行Sou

7、thernblot實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建了pHY106-BHBV和pHY106-CHBV兩個(gè)表達(dá)載體； 2．DHY106-BHBV和pHY106-CHBV轉(zhuǎn)到Huh7細(xì)胞后，檢測(cè)到了HBsAg和HBeAg的表達(dá)，HBsAg表達(dá)于48h達(dá)高峰，HBeAg的表達(dá)高峰晚于HBsAg約24h； 3．應(yīng)用Southern blot檢測(cè)到了細(xì)胞內(nèi)HBV核心顆粒內(nèi)的HBV復(fù)制中間體，包括rcDNA，dsDNA和s

8、sDNA； 4．應(yīng)用Real-time PCR定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞內(nèi)的pHY106-BHBV和pHY106-CHBV HBV DNA拷貝數(shù)高，于72h達(dá)高峰，可達(dá)8log10； 5．pHY106-BHBV轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48h后，從4097個(gè)基因中篩選出差異表達(dá)基因共60條，其中1條基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，59條基因表達(dá)降低明顯； 6．pHY106-CHBV轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48h后，篩選出差異表達(dá)基因共122

9、條，其中34條基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，88條基因表達(dá)降低明顯； 7．實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證上述芯片結(jié)果，證實(shí)pHY106-BHBV轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48h后，IFNGR2、GPR125、DDEF2和PI3K mRNA表達(dá)水平均不同程度下調(diào)，相對(duì)表達(dá)率分別為0.8、0.5、0.3和0.4，與基因芯片結(jié)果基本一致；pHY106-CHBV轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48h后，EEF2、INF592表達(dá)下調(diào)，相對(duì)表達(dá)率分別為0.8和0.6，與基因芯片結(jié)果符合。

10、 8．shRNA·458和shRNA-635對(duì)B和C基因型HBV HBsAg和HBeAg表達(dá)具有很強(qiáng)抑制作用，轉(zhuǎn)染后48h顯現(xiàn)明顯的抑制作用，于72h抑制作用達(dá)高峰，對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)抑制水平分別可達(dá)到80％和50％左右； 9．shRNA共轉(zhuǎn)染72h，shRNA·458和shRNA·635對(duì)B和C基因型HBV HBsAgmRNA具有明顯的抑制作用，抑制水平在60％～70％左右； 10.Southern

11、blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-458和shRNA·635對(duì)B和C基因型HBV的復(fù)制具有明顯的抑制作用。 結(jié)論： 1．本研究構(gòu)建成的HBV真核重組表達(dá)載體pHY106-BHBV和pHY106-CHBV能夠在Huh7細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)HBsAg和HBeAg，適合用于B和C基因型HBV的致病機(jī)制、病毒與機(jī)體的相互作用、新藥開(kāi)發(fā)等方面的研究工作。 2．B和C基因型乙型肝炎病毒均能對(duì)Huh7細(xì)胞表達(dá)譜產(chǎn)生明顯的改變，B和C基因