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文檔簡介
1、目的:
構(gòu)建人PPM1D基因的RNA干擾慢病毒載體,測定病毒滴度。檢測結(jié)腸癌細(xì)胞RKO在基因沉默后的細(xì)胞生物學(xué)變化及差異性基因的表達(dá)情況,以探索PPM1D基因在結(jié)腸癌細(xì)胞惡性增殖中的作用及其機(jī)制。
方法:
檢索針對PPM1D的siRNA序列,參考Sigma網(wǎng)站公布的資源,選取一條siRNA序列,同時參考文獻(xiàn)挑選一條通用siRNA陰性對照序列;兩端加上酶切位點(diǎn),合成雙鏈DNA oligo,成為含干擾序列的具對
2、應(yīng)粘性末端的shRNA表達(dá)框架。將shRNA表達(dá)框架插入pFH-L慢病毒骨架質(zhì)粒載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,陽性克隆行PCR鑒定,構(gòu)建含有針對PPM1D的shRNA病毒骨架質(zhì)粒。
用shPPM1D或者對照組的短發(fā)卡RNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞,同時也轉(zhuǎn)染兩個幫助質(zhì)粒,分別是pCMVAR8.92和pVSVG-(I),這兩個質(zhì)粒編碼慢病毒組裝蛋白。應(yīng)用Lipofectamin2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染后48小時,收
3、集包含組裝慢病毒的培養(yǎng)基,使用0.45μm的濾紙進(jìn)行濃縮。病毒滴度確定和校準(zhǔn)后,慢病毒溶液儲存于-80℃。
慢病毒感染,RKO細(xì)胞中加入組裝的慢病毒,在37℃,5%CO2中培養(yǎng)至少3天。轉(zhuǎn)染后收獲RKO細(xì)胞,按照廠家說明書應(yīng)用Trizol提取RNA。應(yīng)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 PPM1D的表達(dá)水平使用TB200應(yīng)用熒光定量混合物性實(shí)時PCR進(jìn)行評價。PPM1D的引物為PPM1D5'-CTACAC
4、CACCAGTCAAGTCAC3'前向)and5'-AGAAGGCATTGCTACGAACC-3'(反向)。PBS沖洗后,收集RKO細(xì)胞,使用RIPA緩沖液進(jìn)行裂解。RIPA緩沖液的組成:20 mM Tris-HCl(pH7.5),150 mM NaCl,1 mM Na2EDTA,1 mM EGTA,1% NP-40,1%脫氧膽酸鈉,2.5 mM焦磷酸鈉,1 mMβ甘油磷酸鹽,1 mM Na3VO4,1μg/ml亮抑酶肽。SDS-PAG
5、E分離蛋白標(biāo)本,轉(zhuǎn)移,與一抗4℃孵育過夜。室溫下二抗孵育1小時后,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Amersham)進(jìn)行觀察。
慢病毒感染后3天,RKO細(xì)胞懸液接種于96孔板,最初的濃度為每孔2000細(xì)胞。然后每孔加入20μl5 mg/ml的MTT。細(xì)胞孵育3小時后,每孔加入100μl的酸化異丙醇(0.01 M HCl)。甲瓚沉淀物溶解后,在595nm光波長度下應(yīng)用酶標(biāo)儀讀板。
慢病毒感染后3天,RKO細(xì)胞懸液接種于6孔板,最初的
6、濃度為每孔1200細(xì)胞。當(dāng)每個單克隆包含50個細(xì)胞以上時,捕獲影像。然后,標(biāo)本使用4%福爾馬林固定并根據(jù)說明書進(jìn)行Giemsa染色,并攝影。
慢病毒感染后3天,收集RKO細(xì)胞,冷PBS重懸,然后4℃下用預(yù)冷的75%乙醇進(jìn)行固定30分鐘。PBS沖洗后,4℃下與含有RNA酶和碘化丙啶的PBS暗室孵育過夜。流式細(xì)胞儀分析標(biāo)本,數(shù)據(jù)使用多周期AV軟件進(jìn)行分析。
結(jié)果:
GFP熒光證明,慢病毒的轉(zhuǎn)染率很高,實(shí)驗(yàn)組和對
7、照組類似。使用RT-PCR,我們測量了PPM1D的mRNA水平。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了Lv-shPPM1D后,與未轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒者,其表達(dá)水平下降了60%左右。蛋白水平使用Western印跡法進(jìn)行評價。我們發(fā)現(xiàn)Lv-shPPM1D可以顯著降低內(nèi)源性PPM1D的蛋白水平。
為研究結(jié)直腸癌細(xì)胞中PPM1D沉默的效應(yīng),檢測了增殖和群落形成能力。Lv-shPPM1D感染后,增殖率與非感染或?qū)φ战M的增殖率下降了。然后分析了RKO細(xì)胞的群落
8、形成能力。PPM1D沉默可以顯著減少RKO細(xì)胞的群落形成能力。使用Giemsa染色,我們發(fā)現(xiàn)單個群落中細(xì)胞數(shù)目顯著減少。上述證據(jù)提示內(nèi)源性PPM1D的表達(dá)減少可以顯著抑制結(jié)直腸癌的生長。
為研究是否PPM1D敲除誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制是否是由于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失調(diào),行流式細(xì)胞儀檢測。Lv-shPPM1D感染誘導(dǎo)RKO細(xì)胞集中在細(xì)胞周期的G0/G1期。在Lv-shPPM1D感染組,45.87±0.64%的RKO細(xì)胞在細(xì)胞周期的G0/G1
9、期,這比非感染組(38.67±0.93%)和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(42.60±0.95%)顯著升高。在PPM1D沉默組,44.00%±0.17%的RKO細(xì)胞處于細(xì)胞周期的S期,這比非感染組(52.20±0.62%)和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(48.50±1.25%)顯著降低。我們進(jìn)一步分析了處于亞G1期的細(xì)胞比例。PPM1D敲除后,5.98±0.35%的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的亞G1期,這比非感染組(1.47±0.11%)和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(1.70±0.08
10、%)顯著升高。這些結(jié)果提示敲除PPM1D后誘導(dǎo)細(xì)胞聚集于亞G1期,導(dǎo)致細(xì)胞增殖和群落形成受抑制。
為進(jìn)一步研究PPM1D沉默誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長抑制的機(jī)制,我們分析了細(xì)胞生長相關(guān)信號分子的表達(dá)水平。CyclinB1和CyclinD1是細(xì)胞周期控制中的調(diào)節(jié)性蛋白。我們發(fā)現(xiàn)敲除PPM1D導(dǎo)致CyclinB1的下調(diào),而不影響CyclinD1的表達(dá)水平。由于細(xì)胞增殖中ERK信號傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用,而PPM1D依賴于ERK活化,我們評價
11、了PPM1D敲除后ERK的活化。我們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中抑制PPM1D的表達(dá)后,磷酸化的ERK減少了。而且,由于AKT磷酸化也與細(xì)胞增殖有關(guān),我們檢測了AKT通路的活化。我們發(fā)現(xiàn)Lv-shPPM1D敲除PPM1D后,磷酸化AKT的數(shù)目顯著增加。上訴這些證據(jù)說明應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA沉默抑制PPM1D表達(dá),可以通過抑制CyclinB1/ERK通路抑制結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖。
結(jié)論:
RNA干擾技術(shù)是廣泛應(yīng)用的是目標(biāo)基因沉默的
12、技術(shù),它作用于mRNA水平,而且慢病毒可以使干擾RNA有效的傳遞到目標(biāo)細(xì)胞。
Lv-shPPM1D可以有效的減少內(nèi)源性的PPM1D表達(dá),從而抑制結(jié)直腸RKO細(xì)胞的細(xì)胞增殖和群落形成。PPM1D敲除可以導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G0/G1相,細(xì)胞聚集在亞G1期,從而導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制。
PPM1D敲除可以誘導(dǎo)CyclinB1和磷酸化-ERK的下調(diào),而不影響CyclinD1的表達(dá)。PPM1D敲除可以促進(jìn)AKT磷酸化,提示PI3K/
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