聯合應用Rho-ROCKII及GSK-3β抑制劑促進新生大鼠DRGNs軸突再生的體外實驗研究.pdf

1、目的： （1）觀察完全性截癱大鼠脊髓提取液對新生大鼠背根節(jié)神經元（DRGNs）軸突生長的影響； （2）觀察聯合應用Rho—ROCKⅡ和GSK—3β抑制劑對大鼠背根節(jié)神經軸突再生和延長的影響。 方法： （1）健康雌性SD成年大鼠15只，隨機分為：手術癱瘓組（5只）、假手術對照組（5只）和正常組（5只）。WD法制成SD大鼠T9平面完全性截癱的脊髓損傷動物模型，造模7d后取T8—10節(jié)段脊髓制作脊髓提取液。

2、 （2）新生大鼠DRGNs體外培養(yǎng)：取新生SD大鼠（<5d），顯微操作下取胸腰段背根節(jié)（20～25個/只），酶解消化、機械吹打、離心、重懸、純化，進行元代培養(yǎng)觀察與鑒定。 （3）實驗一分組：A組，DRGNs+PBS；B組，DRGNs+正常脊髓提取液：C組，DRGNs+假手術脊髓提取液；D組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液。 （4）實驗二分組：A組，DRGNs+PBS；B組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液；

3、C組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液+Y26732；D組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液+TDZD—8；E組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液+Y26732+TDZD—8。 （5）觀察指標：共同培養(yǎng)1、2d后相差顯微鏡下照相、固定后免疫熒光，觀察神經軸突長度、TubulinβⅢ陽性表達以及軸突遠端平均熒光密度，實驗結果采用SPSS13.0統計軟件做單因素方差分析。 結果： （1）實驗一各組共同培養(yǎng)

4、1d平均神經軸突長度：A組為144±28um，B組為134±11um，C組為125±30um，D組為47±5um；共同培養(yǎng)2d后：A組為211±21um，B組為182±15um，組為156±13um，D組80±8um。共同培養(yǎng)1、2d后，D組和A、B、C組之間分別比較差別有顯著性；C組和A、B組之間分別比較差別有統計學意義；A和B組之間比較差別無統計學意義。共同培養(yǎng)2d后，軸突遠端平均熒光密度分別是：A組為200.4±4.0AFU/um

5、，B組為199.2±6.6 AFU/um，C組為194.6±7.0AFU/um；D組為75.1±4.1AFU/um。在A組和B組中，神經軸突干和生長錐的TubulinβⅢ陽性表達強，而C組中TubulinβⅢ陽性表達弱，D組比C組TubulinβⅢ陽性表達更弱，特別在軸突遠端和生長錐。D組和A、B、C組之間分別比較差別有顯著性； A、B、C組之間比較差別無統計學意義。 （2）實驗二各組共同培養(yǎng)2d后平均神經軸突長度：A組為402

6、±33um，B組為125±18um，C組為404±14um，D組為398±41um，E組為405±12um。B與其他組之間兩兩比較均有顯著統計學意義；C、D、E組之間比較無統計學意義。共同培養(yǎng)2d后，軸突遠端平均熒光密度分別是：A組為208.2±5.6 AFU/Um，B組為67.1±4.2 AFU/um，C組為362.6±5.6 AFU/um，D組為365.6±39.3AFU/um，E組為379.8±23.6 AFU/um。在A、C、D

7、和E組中，神經軸突干和生長錐的TubulinβⅢ陽性表達強，而B組中TubulinβⅢ陽性表達弱，特別在軸突遠端和生長錐。B組和其他組差別均有顯著統計學意義，E組和A、C、D組差別有統計學意義。 結論： （1）完全癱瘓脊髓提取液能明顯抑制DRGNs軸突生長，導致生長錐塌陷；假手術脊髓提取也能輕度抑制軸突生長，但生長錐無明顯塌陷；正常脊髓不影響軸突生長。 （2）30uMY27632能明顯促進軸突生長，形成細長的生長