Rho激酶抑制劑法舒地爾抑制人腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 人腦膠質(zhì)瘤是人類顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率最高的一類腫瘤,其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見、惡性程度最高的組織學(xué)類型。目前治療腦膠質(zhì)瘤的方法主要包括了手術(shù)切除、放療和化療。但是,即使在臨床手術(shù)技術(shù)日益提高的今日,腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后依然很差。因此,在對人腦膠質(zhì)瘤的治療研究中,尋找一種更加有效的治療方法成為一項刻不容緩的課題。在已經(jīng)完成的實驗研究中,發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高度增殖能力和侵襲性是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗的主要因為。

2、　　 盡管人腦膠質(zhì)瘤很少在全身其他系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移,但其細(xì)胞對周圍組織的浸潤和腦組織中較遠(yuǎn)部位的侵襲是膠質(zhì)瘤自然病程發(fā)展的必然結(jié)局。腫瘤細(xì)胞為了能夠侵入周圍組織,必須經(jīng)歷以下幾步:從其周圍的組織和細(xì)胞上脫離下來,穿過基底膜,在細(xì)胞外基質(zhì)中遷移,到達(dá)新的組織部位并在此增殖,最終形成新腫瘤。在這一過程中,分解細(xì)胞外基質(zhì)并在其中遷移是一個關(guān)鍵步驟。而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)又在分解細(xì)胞外基質(zhì)中的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。MMPs是一族結(jié)構(gòu)與功能上相

3、關(guān)的內(nèi)肽水解酶類,屬于Metzincin超家族,具有分解各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的能力。在最近的研究中表明,MMPs在多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過程中扮演了非常重要的角色,其中MMP-2和MMP-9在人腦膠質(zhì)瘤侵襲性的相關(guān)研究中最受關(guān)注。
　　 Rho是一種小G結(jié)合蛋白,在細(xì)胞功能中發(fā)揮著多重作用,其中比較重要的一個作用就是維持肌球蛋白絲的收縮功能。這種收縮功能形成了細(xì)胞的張力纖維并維持著與細(xì)胞間的相互粘附。Rho下游有多種效應(yīng)蛋白,最

4、重要的是絲氨酸/蘇氨酸激酶,即Rho蛋白相關(guān)激酶(ROCK)。有研究證實,在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中(T98G、U251)ROCK呈高表達(dá)；在對臨床標(biāo)本的分析研究中,ROCK的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。ROCK已經(jīng)成為膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)研究的熱點之一,但大多數(shù)研究局限于其在細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)中的作用及其對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響。
　　 法舒地爾(Fasudil)作為一種特異性的ROCK阻斷劑,被證實能夠通過改變平滑肌細(xì)胞中的肌

5、球蛋白輕鏈的磷酸化而達(dá)到抑制血管痙攣的作用。在臨床治療中被用于控制蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的腦血管痙攣以及相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血癥狀。在一系列臨床前期研究中,Fasudil可能對多種心腦血管疾病有治療作用,如冠狀動脈痙攣引起的心絞痛、高血壓、肺動脈高壓、腦卒中和心衰等。目前,未見有Fasudil對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作用的的相關(guān)研究報道。
　　 方法和結(jié)果
　　 為了闡明Fasudil對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用及其內(nèi)在機(jī)制,兩種人類

6、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251作為本課題的研究對象。用不同濃度的Fasudil分別處理這兩種細(xì)胞,并觀察由Fasudil引起的細(xì)胞生物學(xué)特性的變化,包括細(xì)胞形態(tài)、增殖、侵襲和凋亡等方面。由于假定MMPs在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起到了關(guān)鍵作用,因此檢測了Fasudil是否影響MMPs和MMPs的負(fù)性調(diào)節(jié)因子TIMPs的表達(dá)。為了進(jìn)一步探索Fasudil這一已經(jīng)用于臨床治療的藥物在體內(nèi)是否也發(fā)揮了同樣的作用,本課題建立了顱內(nèi)綠

7、色熒光標(biāo)記的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠動物模型,通過尾靜脈給藥對體內(nèi)腫瘤進(jìn)行處理,將腫瘤組織進(jìn)行冰凍切片鏡下觀察并繪制荷瘤鼠生存曲線。
　　 一、ROCK抑制劑法舒地爾抑制人腦膠質(zhì)瘤的體外實驗研究
　　 1.法舒地爾改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)
　　 用不同濃度的法舒地爾處理T98G和U251細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),24h后細(xì)胞形態(tài)改變,細(xì)胞突觸增多增長且胞體變細(xì)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的這種變化表現(xiàn)為法舒地爾的濃度依賴性和時間依賴性。在100μM的高濃度

8、法舒地爾處理組,細(xì)胞完全失去正常形態(tài),突觸長達(dá)胞體的數(shù)倍之多。
　　 為了驗證法舒地爾的這種作用是否為可逆過程,在處理完24h后進(jìn)行了恢復(fù)實驗。實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過24h不同濃度法舒地爾處理,低濃度組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在更換全新培養(yǎng)基之后的24h內(nèi),恢復(fù)了正常的細(xì)胞形態(tài):而高濃度組的細(xì)胞則無法從拉伸變長、突觸增多的星形形態(tài)中恢復(fù)至正常。
　　 2.法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響
　　 2.1法舒地爾抑制GBM的遷移

9、
　　 損傷修復(fù)實驗被用來測定膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運動遷移能力。用10μL移液器吸頭在膠質(zhì)瘤單細(xì)胞層上作出一道劃痕,并以不同濃度的法舒地爾及陽性對照進(jìn)行處理,顯微鏡下將劃痕寬度的變化進(jìn)行拍照記錄。實驗結(jié)果顯示,法舒地爾濃度依賴的抑制了兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。
　　 2.2法舒地爾抑制GBM的侵襲
　　 Transwell(R)小室被用來檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞在法舒地爾的作用下侵襲能力的變化。經(jīng)過24.h的侵襲,將Transwell

10、(R)小室下表面的已穿膜細(xì)胞染色并計數(shù),從而得到膠質(zhì)瘤細(xì)胞相對侵襲力的數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果顯示,法舒地爾能濃度依賴的抑制T98G和U251細(xì)胞的侵襲能力。但數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),法舒地爾對侵袋的抑制作用要高于其對遷移的抑制作用。
　　 3.法舒地爾抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2的表達(dá)
　　 RT-PCR法檢測法舒地爾對侵襲相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。選擇20μM的法舒地爾和siRNA分別處理兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞,提取總RNA并進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MM

11、P-2/-9、TIMP1/2/3等侵襲相關(guān)基因中,只有MMP-2轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,且隨法舒地爾的濃度升高,MMP-2的轉(zhuǎn)錄水平相應(yīng)降低。之后為了進(jìn)一步確認(rèn)法舒地爾對MMP-2的抑制作用,又運用Western Blot和明膠酶譜法從蛋白水平和分泌水平上驗證了RT-PCR的結(jié)果。
　　 4.法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 用[3H]脫氧胸腺嘧啶核苷酸摻入法測定了法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),法舒地爾

12、在高濃度下處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h能濃度依賴的抑制T98G和U251細(xì)胞的增殖。用流式細(xì)胞術(shù)檢測法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞早期凋亡率的影響,結(jié)果表明在低濃度下法舒地爾在24h的處理后也可以引起細(xì)胞的凋亡,且成濃度依賴性。
　　 二、ROCK抑制劑法舒地爾抑制人腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)實驗研究
　　 1.建立穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白eGFP-T98G人腦膠質(zhì)瘤裸鼠顱內(nèi)原位移植模型
　　 用LipofectamineTM2000向T9

13、8G中轉(zhuǎn)染帶有表達(dá)eGFP和G418抗性的質(zhì)粒,G418加壓篩選陽性細(xì)胞,通過有限稀釋法將陽性細(xì)胞傳代于96孔板中,挑選單克隆細(xì)胞株,分離培養(yǎng)并在熒光顯微鏡下觀察鑒定為穩(wěn)定表達(dá)eGFP的T98G細(xì)胞系(eGFP-T98G)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)擴(kuò)增后,選取合適的細(xì)胞濃度,用鼠腦立體定向儀將eGFP-T98G細(xì)胞懸液種植于裸鼠尾狀核。體視熒光顯微鏡下觀察裸鼠移植瘤模型的成瘤情況。
　　 2.法舒地爾抑制人腦膠質(zhì)瘤體內(nèi)的增殖和侵襲
　

14、　 在裸鼠接種成瘤第14天,分別對治療組和對照組經(jīng)尾靜脈給藥(法舒地爾濃度50μg/100μL)。通過大體觀察測量、鼠腦冰凍切片和繪制生存曲線等方式檢測法舒地爾對人腦膠質(zhì)痛體內(nèi)生長的作用。結(jié)果顯示,法舒地爾能有效抑制人腦膠質(zhì)瘤在裸鼠體內(nèi)的生長和對周圍組織的侵襲,接受治療的裸鼠生存時間較對照組有顯著延長。
　　 結(jié)論
　　 在本研究中,我們首先發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)Fasudil能夠引起人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,并能降低T98G和

15、U251細(xì)胞的遷移和侵襲。但Fasudil對腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲抑制作用的強(qiáng)弱并不一致,這種差異引導(dǎo)本課題進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,即Fasudil對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲抑制的機(jī)制研究。通過一系列的實驗我們發(fā)現(xiàn),在常見的腫瘤侵襲相關(guān)基因中(MMPs和TIMPs),只有MMP-2的表達(dá)能夠被Fasudil抑制,這一結(jié)果同樣在其他的ROCK抑制劑和ROCK-siRNA的陽性對照實驗中得到了驗證。我們又發(fā)現(xiàn),Fasudil能夠明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的