高產(chǎn)他克莫司基因工程菌的構(gòu)建及他克莫司MPEG-PLA納米膠束治療肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的研究.pdf

1、氧氣的供給往往是發(fā)酵過程中影響產(chǎn)物產(chǎn)率的一個(gè)限制因素，因此充足的氧供成為發(fā)酵穩(wěn)定、產(chǎn)量提高和降低成本的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的供氧方法如增加通氣量等存在著高耗能和對(duì)設(shè)備條件的要求苛刻等問題。20世紀(jì)70年代末透明顫菌(Vitreoscilla)中血紅蛋白(VitreoscillaHemoglobin，VHb)的發(fā)現(xiàn)，促使血紅蛋白基因工程走上舞臺(tái)并對(duì)抗生素工業(yè)和其他藥物發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展起了巨大推動(dòng)作用。將透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscilla

2、Hemoglobingene，vgb)通過基因工程的手段轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，構(gòu)建工程菌，可以大大提高發(fā)酵菌株對(duì)氧的利用率，從而提高產(chǎn)量，節(jié)約成本。
　　納米技術(shù)是指利用單個(gè)原子、分子制造物質(zhì)的科學(xué)技術(shù)，研究結(jié)構(gòu)尺寸在0.1至100nm范圍內(nèi)材料的性質(zhì)和應(yīng)用。納米藥物是指運(yùn)用納米技術(shù)和納米載體制備的一類藥物新制劑。這其中，納米膠束作為一種多功能納米技術(shù)在難溶性藥物的遞送研究中獲得了巨大的關(guān)注，其載藥能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、制備工藝簡(jiǎn)單、載體多樣

3、性、體內(nèi)可降解、跨膜能力強(qiáng)及對(duì)抗腸道上皮p-糖蛋白等特點(diǎn)，被認(rèn)為是未來提高難溶性藥物口服生物利用度的主要研究方向。
　　本研究通過對(duì)vgb基因工程菌的構(gòu)建、新型納米載體材料的合成、納米膠束的制備及體內(nèi)外藥學(xué)性質(zhì)的考察等研究，為他克莫司原料和新劑型的開發(fā)研究及未來應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。課題主要研究方法與結(jié)果如下。
　　1.Vgb基因工程菌的構(gòu)建及vgb基因?qū)λ四井a(chǎn)量影響的研究
　　首先，通過傳統(tǒng)的紫外誘變技術(shù)初步提高筑波鏈霉

4、菌(Streptomycestsukubaensis)發(fā)酵產(chǎn)他克莫司的產(chǎn)量。紫外誘變條件為:孢子濃度為107～108CFU/mL，15W紫外燈管距離20cm照射100s，致死率可達(dá)90％以上。在此條件下，以白色念球菌為指示菌進(jìn)行雙層平板抑菌實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)HPLC最終測(cè)定他克莫司的量，獲得兩株正突變菌株，他克莫司產(chǎn)量最大提高量為27.7％。其次利用基因工程技術(shù)進(jìn)一步提高他克莫司產(chǎn)量。PCR擴(kuò)增vgb基因，構(gòu)建含vgb基因的重組質(zhì)粒，采用大腸桿

5、菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移的方式將重組質(zhì)粒整合入鏈霉菌基因組中，獲得重組vgb基因工程菌。經(jīng)CO-差光譜分析法檢測(cè)到重組菌株中表達(dá)的有活性的VHb，證實(shí)重組vgb基因筑波鏈霉菌的成功構(gòu)建。與原始菌相比，插入vgb基因的重組菌株在控氧條件下發(fā)酵他克莫司產(chǎn)量提高了兩倍。最后，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定的發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖25g/L，糊精80g/L，甘油10g/L，豆餅粉10g/L，大豆蛋白胨10g/L。通過對(duì)種齡與接種量的優(yōu)化，確

6、定了筑波鏈霉菌工程菌在種子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)20h，以2％的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基為最佳條件。經(jīng)過優(yōu)化后的他克莫司產(chǎn)量最高可達(dá)127.78～130.31mg/L。這些結(jié)果為提高工業(yè)菌中他克莫司及其他抗生素產(chǎn)量提供了一個(gè)有效的策略。
　　2.他克莫司甲氧基聚乙二醇-聚乳酸納米膠束的制備、表征及體外釋放行為研究
　　以辛酸亞錫為催化劑，由丙交酯和單甲氧基聚乙二醇通過開環(huán)聚合反應(yīng)合成了不同嵌段比的兩親性二嵌段聚合物甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(

7、MPEG-PLA)，經(jīng)過篩選，嵌段比為1∶1的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(MPEG5000-PLA5000)共聚物裝載他克莫司所形成的納米膠束效果最佳。選擇乳液溶劑去除法制備納米膠束，并采用均勻設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方及工藝，確定最優(yōu)處方為:4.5％的MPEG-PLA的四氫呋喃溶液作為有機(jī)相，他克莫司的投藥量為5mg，油/水比例1∶20。優(yōu)化后制得納米膠束呈球形外觀，符合核-殼結(jié)構(gòu)的特征。平均粒徑為90.5nm，分散均勻（PDI=0.100±

8、0.023），載藥量達(dá)到9.5％，包封率98.8％。體外釋放結(jié)果顯示，他克莫司納米膠束具有明顯的緩釋特性，對(duì)體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合，符合Higuchi方程，其相關(guān)系數(shù)最大為0.9992。體外安全性實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)MPEG5000-PLA5000載體材料濃度為1000μg/mL時(shí)，HEK293細(xì)胞存活率達(dá)到70％以上，說明該載體材料安全性較好，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性。
　　3.他克莫司甲氧基聚乙二醇-聚乳酸納米膠束大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及肝移

9、植大鼠體內(nèi)藥效學(xué)研究
　　以上市他克莫司膠囊為對(duì)照，研究了他克莫司納米膠束大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律，建立肝移植大鼠模型，并進(jìn)行了肝移植大鼠藥效學(xué)研究。
　　他克莫司納米膠束大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，與口服他克莫司膠囊相比，他克莫司納米膠束給藥后吸收速度更快，Tmax由3h提前至1h，半衰期和平均滯留時(shí)間均延長(zhǎng)，分別由13.698h和23.593h延長(zhǎng)至16.573h和24.044h，生物利用度明顯提升，藥-時(shí)曲線下面積由508.

10、251ng/mL·h提高至886.703ng/mL·h。本研究實(shí)現(xiàn)了納米膠束增強(qiáng)吸收、提高生物利用度和緩釋的作用。肝移植大鼠體內(nèi)藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，他克莫司納米膠束組能更好地延長(zhǎng)肝移植大鼠的生存期。移植后大鼠給予他克莫司納米膠束后谷丙轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素水平明顯低于對(duì)照組;肝臟病理圖片結(jié)果表明，他克莫司納米膠束能夠更好地對(duì)抗排斥反應(yīng)所造成的肝損傷，起到肝臟保護(hù)作用。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建的vgb基因筑波鏈霉菌工程菌能夠顯著改善發(fā)酵