他克莫司生物合成相關(guān)基因研究及其產(chǎn)生菌遺傳改造.pdf

1、他克莫司(FK506)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種23元大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，是肝和腎等器官移植后抗排斥反應(yīng)的一線用藥，已在多個國家上市。然而作為一種微生物的發(fā)酵產(chǎn)物，F(xiàn)K506存在效價低、副產(chǎn)物多等問題。因此，通過研究其產(chǎn)生菌中影響FK506生物合成的相關(guān)基因，能夠為通過基因工程改善該菌的發(fā)酵特性、降低生產(chǎn)成本等創(chuàng)造有利條件。
　　本研究以鏈霉菌Streptomyces sp.TL01為出發(fā)菌株，研究了FK506生物合成及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

2、編碼基因、次級代謝相關(guān)基因以及外源的顫血紅蛋白編碼基因分別對菌株發(fā)酵和代謝產(chǎn)物生物合成的影響。以LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子編碼基因fkbN，LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子編碼基因tcs7，初級代謝途徑中參與合成或消耗NADPH的酶編碼基因zwf2和gltD，催化乙酰CoA生成丙二酰CoA的酶編碼基因bccA2，催化他克莫司生物合成后修飾的C31位氧甲基化酶編碼基因fkbM，及用于提高菌株氧結(jié)合水平的顫血紅蛋白編碼基因vgb等作為目標(biāo)基因，借

3、助分子生物學(xué)的手段，通過酶切酶連完成重組質(zhì)粒構(gòu)建后，經(jīng)大腸桿菌-鏈霉菌的屬間接合轉(zhuǎn)移，將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入到受體菌Streptomyces sp.TL01中，篩選獲得基因工程菌后，搖瓶發(fā)酵考察其發(fā)酵特性。
　　HPLC分析顯示:fkbN倍增菌株發(fā)酵效價降低32％，fkbN基因敲除菌株不產(chǎn)FK506;tcs7的倍增菌株發(fā)酵效價降低了54％，敲除菌株發(fā)酵效價增加6％，發(fā)酵水平基本與出發(fā)菌株相當(dāng);zwf2基因倍增菌株發(fā)酵效價增加13％;

4、bccA2敲除菌株發(fā)酵效價降低9％;而gltD的敲除使FK506的發(fā)酵效價增加135％; fkbM基因倍增菌株發(fā)酵效價增加13％;而整合表達啦的Streptomyces sp.TL01，其FK506發(fā)酵效價變化不大，但菌體干重明顯增加。
　　由結(jié)果推測fkbN可能為FK506生物合成所必需的負調(diào)控基因，tcs7則對他克莫司的合成起負調(diào)控作用;zwf2和bccA2的倍增對他克莫司發(fā)酵單位影響不大;而gltD敲除菌株發(fā)酵效價明顯提高;