CXCR4啟動(dòng)的條件復(fù)制型腺病毒聯(lián)合DAL-1轉(zhuǎn)染人羊水干細(xì)胞對(duì)肺癌的治療作用.pdf

1、療提供一種新的策略。 方法 方法 一、條件復(fù)制型腺病毒載體 Ad-CXCR4-DAL-1 和 Ad-CXCR4-GFP 的構(gòu)建：構(gòu)建重組質(zhì)粒 pAdxsi-CXCR4-DAL-1 和 pAdxsi-CXCR4-GFP， 利用 293 細(xì)胞包裝成條件復(fù)制型腺病毒 Ad-CXCR4-DAL-1 和 Ad-CXCR4-GFP；TCID50 法測(cè)定Ad-CXCR4-DAL-1 和 Ad-CXCR4-GFP 滴度。 二 、 CXCR4 在 A54

2、9 細(xì) 胞 內(nèi) 啟 動(dòng) 活 性的 檢 測(cè) 、 條 件 復(fù) 制型 腺 病 毒Ad-CXCR4-DAL-1 轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞后復(fù)制數(shù)和 DAL-1 表達(dá)的檢測(cè)： 熒光定量 PCR檢測(cè) 5 種肺癌細(xì)胞株 CXCR4mRNA 表達(dá)，篩選出表達(dá)最高的 A549 細(xì)胞；將構(gòu)建的 Ad-CXCR4-DAL-1（實(shí)驗(yàn)組） 、Ad-CXCR4-GFP（對(duì)照組）和 Ad-NULL（空載體組） 分別轉(zhuǎn)染至 A549 細(xì)胞中， 熒光定量 PCR 檢測(cè)各組

3、E1AmRNA、 E4 DNA和 DAL-1 mRNA 表達(dá)；Western Blot 檢測(cè)各組 DAL-1 蛋白的表達(dá)。 三、條件復(fù)制型腺病毒 Ad-CXCR4-DAL-1 功能的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分四組：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空載體組和空白對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組分別轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞和 16HBE 細(xì)胞后的凋亡率；CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組分別轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞和 16HBE細(xì)胞后的細(xì)胞毒性，計(jì)算各組細(xì)胞活性率。 四、條件復(fù)制型腺病毒 Ad

4、-CXCR4-DAL-1 體內(nèi)抑瘤作用的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分三組：實(shí)驗(yàn)組、空載體組和 PBS 組。2*106 個(gè) A549 細(xì)胞重懸于 200μLPBS，注射至裸鼠皮下，建立裸鼠 A549 細(xì)胞移植瘤模型。瘤內(nèi)注射各組病毒，每隔 1 天注射 1 次，每次每只 1*109PFU，共 4 次。觀察各組腫瘤生長(zhǎng)速度和腫瘤體積；末次注射后的第 21 天處死全部裸鼠，分別稱取各組裸鼠腫瘤重量，各組均取出腫瘤、 肝臟和肺臟， 熒光定量 PCR 檢測(cè)各組腫瘤

5、、 肝臟和肺臟中 E4 DNA 和 DAL-1 mRNA 表達(dá)。 五、人羊水干細(xì)胞的分離與鑒定：采用貼壁法分離培養(yǎng)人羊水干細(xì)胞；對(duì)第2 代人羊水干細(xì)胞進(jìn)行核型分析；流式細(xì)胞儀檢測(cè)第 2 代人羊水干細(xì)胞表面抗原分子的表達(dá)；CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)第 2 代人羊水干細(xì)胞的增殖情況，連續(xù)檢測(cè) 5 天，根據(jù)吸光度（OD）值描繪生長(zhǎng)曲線。 無(wú)明顯差異（P>0.05） ，第5天活性率明顯降低（P0.05） ；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組前3天細(xì)胞凋亡率和

6、細(xì)胞活性率無(wú)明顯差異（P>0.05） ，第4天凋亡率增加（P0.05）；熒光定量 PCR 顯示，實(shí)驗(yàn)組 E4 DNA 和 DAL-1 mRNA 表達(dá)較空載體組與 PBS 組明顯增加（P0.05） ；熒光定量 PCR 顯示，實(shí)驗(yàn)組 E4 DNA 和 DAL-1 mRNA 表達(dá)較空載體組、hAFS 組和 PBS 組明顯上升（P<0.01） 。各組肝臟和肺臟均無(wú) E4 DNA 和DAL-1 mRNA 表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)證明條件復(fù)制型腺病