2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的:利用腺病毒載體將hBMP-2基因轉(zhuǎn)染于ADSCs,并將其局部注入骨質(zhì)疏松性骨折模型兔的骨折處,觀察其對(duì)骨折修復(fù)的影響。
  方法:(1)將所獲得的新西蘭兔頸背部脂肪組織用無(wú)酶法分離、提取ADSCs,行傳代培養(yǎng)后取P3細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定CD44、CD49d、CD34、CD106特異性表面抗原。P3細(xì)胞行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后,利用茜紅素染色對(duì)其成骨分化能力做進(jìn)一步鑒定。
  (2)通過(guò)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增Ad-hBMP-2/

2、GFP。經(jīng)反復(fù)感染、凍融后,收集并純化病毒液,以MOI100將其接種于ADSCs,培養(yǎng)至6d時(shí)置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至第10d的ADSCs行RT-PCR檢測(cè)hBMP-2 mRNA表達(dá),并用免疫熒光法檢測(cè)不同時(shí)間段hBMP-2蛋白的表達(dá)情況。
  (3)取骨質(zhì)疏松模型兔60只,隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組(20只)、未轉(zhuǎn)染組(20只)、空白對(duì)照組(20只)并人為切斷股骨干(深度達(dá)橫截面1/3),每組兔于骨折術(shù)后24h內(nèi)分別行以

3、下處理:局部注射轉(zhuǎn)染ADSCs;局部注射未經(jīng)轉(zhuǎn)染的ADSCs;局部注射生理鹽水。分別取注射后第2、4、7周的三組模型兔,X線攝片后用半定量評(píng)分法對(duì)骨折恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)分并對(duì)骨折處行骨密度檢查,所得數(shù)據(jù)由SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析:3組數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),單因素方差分析評(píng)價(jià)總體差異后,再利用SNK檢驗(yàn)對(duì)不同組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較。
  結(jié)果:(1)將獲得的ADSCs置于相差顯微鏡下觀察顯示:經(jīng)培養(yǎng)72h后,可見有呈成纖維細(xì)胞樣細(xì)

4、胞析出并快速增殖,在第6日時(shí)鋪滿瓶底。析出的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)特征。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢驗(yàn)P3細(xì)胞表面特異性抗原,結(jié)果表明80%以上細(xì)胞表面抗原CD44、CD49d呈陽(yáng)性反應(yīng),CD34、CD106為陰性。茜紅素染色檢測(cè)結(jié)果:P3細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至21d時(shí),顯微鏡下觀察有若干紅染鈣結(jié)節(jié)形成,證實(shí)獲得了較高純度的ADSCs。
  (2)構(gòu)建完成的Ad-hBMP-2/GFP按MOI100感染HEK293細(xì)胞,3d后HEK293

5、細(xì)胞可出現(xiàn)完全 CEP現(xiàn)象。檢測(cè)腺病毒滴度可達(dá)5×108 PFU/ml。將純化后的Ad-hBMP-2/GFP按MOI100感染ADSCs并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,6d時(shí)GFP表達(dá)量達(dá)高峰,此時(shí)轉(zhuǎn)染率約85%。RT-PCR檢測(cè)hBMP-2 mRNA表達(dá):轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)440bp的hBMP-2 cDNA片段,未轉(zhuǎn)染組未見hBMP-2 cDNA特異性條帶顯影。免疫組織學(xué)檢查,hBMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs后7d,ADSCs胞質(zhì)中可見明顯hBMP-2蛋白表達(dá)

6、。
  (3)各時(shí)段3組動(dòng)物X線評(píng)分及骨密度數(shù)據(jù)方差具有齊次性(P>0.05),單因素方差分析有顯著性差異(P<0.05)。不同時(shí)段各組兔X線評(píng)分SNK檢驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組骨折愈合 X射線評(píng)分較空白對(duì)照組高(P<0.05)。轉(zhuǎn)染組骨折愈合 X射線評(píng)分高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。骨折處骨密度數(shù)據(jù)SNK檢驗(yàn)結(jié)果提示:局部注射2周后3組骨痂密度均有所增高,但空白對(duì)照組明顯低于轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組(P<0.05),骨密度檢測(cè)值轉(zhuǎn)染

7、組較未轉(zhuǎn)染組高,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);第4周時(shí),3組骨痂處骨密度均進(jìn)一步增高,趨勢(shì)延續(xù)第2周(P<0.05);第7周,轉(zhuǎn)染組骨痂骨密度較另外兩組明顯降低(P<0.05),空白對(duì)照組高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
  結(jié)論:
  (1)利用無(wú)酶法可獲得較高純度ADSCs。
  (2) Ad-hBMP-2成功轉(zhuǎn)染的ADSCs可明顯表達(dá)hBMP-2蛋白。
  (3) hBMP-2轉(zhuǎn)染后的ADSCs局部注射

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