水合淫羊藿素(Icaritin)對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病體外和體內(nèi)的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic myeloid leukemia，CML）是以費(fèi)城染色體（Philadephia，Ph）為特征的多潛能造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其惡性克隆的持續(xù)擴(kuò)充與細(xì)胞增殖和凋亡速率不平衡有關(guān)。CML具有特征性的染色體異位t（9，22）（q34，q11），產(chǎn)生Bcr/Abl融合基因，編碼蛋白質(zhì)P210，后者在CML的發(fā)病過程中有重要作用。研究表明，P210可促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，延緩其凋亡。對(duì)CML的治療，傳統(tǒng)方法包括

2、羥基脲、α-干擾素、異基因造血干細(xì)胞移植及近年來的酪氨酸激酶抑制劑－格列衛(wèi)的應(yīng)用，盡管治療效果有很大改善，對(duì)慢粒急變的治療效果仍不樂觀。因此，尋找CML新的治療方法仍是CML研究的目標(biāo)。 近年來，用傳統(tǒng)中藥提取物篩選抗白血病治療藥物獲得了一些信息，如苦參堿（Matrine）、姜黃素（Curcumin）和冬凌草甲素（Oridonin）的體外試驗(yàn)表明可抑制多種白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示該類藥物幾乎無不良反應(yīng)。新近上海

3、交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院血研所的研究顯示冬凌草甲素在體內(nèi)外能誘導(dǎo)具有t（8，21）的急性粒細(xì)胞白血病M2型（AML-M2）細(xì)胞株和原代細(xì)胞凋亡，而且副作用小，是一種潛在的抗白血病藥物。因此篩選新型抗白血病中藥有效成分，確定其抗白血病的作用并探討其機(jī)制，已成為國內(nèi)白血病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 K562細(xì)胞株系人CML急性變細(xì)胞株，既具有急性白血病細(xì)胞的特點(diǎn)，又具有CML細(xì)胞特有的本質(zhì)，因此是體外研究篩選抗白血病藥物療效及機(jī)制的良好細(xì)胞模型

4、。水合淫羊藿素是從淫羊藿提純出的甙并經(jīng)水解而成，分子量為368，具有抑制雌激素受體作用。本研究室以前的研究發(fā)現(xiàn)天然水合淫羊藿（Icaritin）對(duì)CML急紅變細(xì)胞株K562細(xì)胞具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并呈濃度依賴性。為了確定Icaritin在體外和體內(nèi)是否具有確切的抗慢粒白血病效應(yīng)，本研究用Icaritin對(duì)CML病人新鮮骨髓白血病細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察Icaritin對(duì)CML原代白血病細(xì)胞是否具有增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用，并對(duì)其分子機(jī)制

5、進(jìn)行探討；用Icaritin對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病NOD-SCID小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察Icaritin對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病NOD-SCID小鼠模型是否具有延長生存期、降低白血病細(xì)胞對(duì)骨髓、肝脾的浸潤，通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)以確定Icaritin的抗白血病作用及機(jī)制。 第一部分 Icaritin對(duì)CML骨髓原代細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用 目的：觀察Icaritin對(duì)CML原代細(xì)胞是否具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。方法：（1）用臺(tái)盼

6、藍(lán)拒染試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)觀察不同濃度的Icaritin對(duì)CML原代細(xì)胞增殖的抑制率的影響；（2）用Annexin V-FITC/PI染色法檢測不同濃度的Icaritin干預(yù)CML原代細(xì)胞后凋亡細(xì)胞的百分率；（3）用Western印跡檢測藥物干預(yù)下的K562細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt-c蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果：（1）Icaritin能以濃度依賴性方式有效地抑制CML原代細(xì)胞增殖，Icaritin抑制CM

7、L原代細(xì)胞活力的IC50為13.5μmol/L（慢性期）、18μmol/L（急變期）；（2）Icaritin能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡；（3）Icaritin誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡伴有Bcl-2和Bax相對(duì)比例的改變、細(xì)胞色素C釋放和Caspase-9、Caspase-3裂解激活。結(jié)論：Icaritin能以濃度依賴性方式有效地抑制CML原代細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)CML原代細(xì)胞凋亡；Icaritin誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡的同時(shí)伴有Bcl-2和

8、Bax相對(duì)比例的改變、細(xì)胞色素C釋放和Caspase-9、Caspase-3裂解激活，提示藥物誘導(dǎo)的CML細(xì)胞凋亡涉及到線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。 第二部分 Icaritin對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的分子機(jī)制 目的：觀察Icaritin作用下K562細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)過程中ER36、ERK、JNK、P38、c-Jun等增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化以及Bcr/Abl mRNA和蛋白表達(dá)變化，揭示Icar

9、itin抗白血病作用的分子機(jī)制。方法：（1）用Western blot分析Icaritin作用下K562細(xì)胞ER36、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38、c-Jun、P-c-Jun和Bcr/Abl蛋白質(zhì)表達(dá)水平；（2）用Real-time PCR定量檢測Bcr/AblmRNA的表達(dá)量。結(jié)果：（1）Icaritin能以濃度依賴性方式抑制K562細(xì)胞ER36、P-ERK和P-P38蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，可上調(diào)P-JNK和

10、P-c-Jun蛋白質(zhì)表達(dá)；（2）Icaritin對(duì)Bcr/Abl mRNA和蛋白表達(dá)無明顯影響。結(jié)論：Icaritin對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)與其下調(diào)雌激素受體活性、調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。 第三部分 Icaritin對(duì)移植K562白血病細(xì)胞的NOD-SCID小鼠模型的體內(nèi)抗白血病作用 目的：確定Icaritin是否對(duì)負(fù)載CML細(xì)胞小鼠具有抗白血病效應(yīng)。方法：建立慢性粒細(xì)胞白血病NOD-SCID小鼠模型

11、，用不同劑量的Icaritin進(jìn)行干預(yù)，并以Imatinib作為陽性對(duì)照。（1）觀察CML負(fù)瘤小鼠的一般狀況、生存時(shí)間；（2）通過瑞氏－吉姆薩染色觀察小鼠骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，通過H.E染色觀察小鼠肝脾病理學(xué)改變；（3）檢測小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD45+白血病細(xì)胞比例；（4）通過免疫組化檢測小鼠脾臟白血病細(xì)胞ER36的表達(dá)。結(jié)果：（1）Icaritin能明顯延長CML負(fù)瘤小鼠的生存期；（2）Icaritin能減輕白血病細(xì)胞對(duì)骨髓、肝脾的