微小RNA在高血糖“代謝記憶”中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分高血糖“代謝記憶”模型的建立
　　目的：建立高血糖“代謝記憶”的動物及細胞模型，觀察“代謝記憶”狀態(tài)下大鼠代謝指標、NF-κB（核轉錄因子-κB）p65亞單位及前炎癥因子的表達變化。
　　方法：
　　1. Wistar大鼠分為3組：（1）正常對照組，注射檸檬酸鈉緩沖液；（2）代謝記憶組，注射鏈脲佐菌素（STZ）成模后維持高血糖水平12周，從第13周開始皮下注射胰島素控制血糖水平在正常范圍；（3）持續(xù)高糖組，注射

2、STZ成模后維持24周高血糖狀態(tài)。
　　2.人主動脈內(nèi)皮細胞（HAECs）分為4組：（1）正糖組，含5.5mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天；（2）滲透壓對照組，含30mM甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天；（3）代謝記憶組，含30mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)1天后，改為含5.5mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)6天；（4）高糖組，含30mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。
　　3.采用實時定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測各組大鼠主動脈組織及細胞樣本中p65、單核細胞趨化

3、因子-1（MCP-1）和白介素-6（IL-6）的mRNA表達水平；采用免疫印跡（Western blot）法檢測p65蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.正常對照組大鼠體重持續(xù)增加，代謝記憶組及持續(xù)高糖組大鼠在注射STZ后體重增加速度均低于正常對照組；代謝記憶組大鼠體重增速高于持續(xù)高糖組，低于正常對照組。
　　2.代謝記憶組大鼠主動脈組織及細胞樣本中p65、MCP-1及IL-6的表達水平上升。
　　結論：

4、　　1.成功建立高血糖“代謝記憶”的動物及細胞模型。
　　2.高血糖“代謝記憶”中p65及前炎癥因子MCP-1、IL-6升高，NF-κB通路持續(xù)激活。
　　第二部分高血糖“代謝記憶”中微小RNA及其靶基因的表達變化
　　目的：分別觀察miR-146a和miR-484在高血糖“代謝記憶”狀態(tài)下的表達變化，通過生物信息學方法尋找并確定其靶基因，觀察靶基因在高血糖“代謝記憶”狀態(tài)下的表達變化。
　　方法：
　　1

5、.采用莖環(huán)熒光實時定量 PCR法檢測各組大鼠主動脈組織及細胞樣本中miR-146a和miR-484表達水平變化。
　　2.使用生物信息學方法尋找miR-146a和miR-484可能的靶基因；檢測各組動物及細胞樣本中靶基因的表達。
　　結果：
　　1.代謝記憶組大鼠主動脈組織及細胞樣本中miR-146a的表達水平下降。
　　2.靶基因預測軟件預測到 miR-146a的靶基因包括白介素-1受體相關激酶1（IRAK1）

6、和腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）；代謝記憶組動物及細胞樣本中IRAK1、TRAF6的蛋白表達水平上升。
　　3.代謝記憶組動物主動脈組織及細胞樣本中miR-484的表達水平下降。
　　4.靶基因預測軟件預測到miR-484的靶基因是血管內(nèi)皮生長因子B（VEGFB）；代謝記憶組動物主動脈組織及細胞樣本中VEGFB的表達水平上升。
　　結論：
　　1.高血糖“代謝記憶”時miR-146a表達下降，其靶基因I

7、RAK1和TRAF6表達增加。
　　2.高血糖“代謝記憶”時miR-484表達下降，其靶基因VEGFB表達增加。
　　第三部分微小RNA在高血糖“代謝記憶”中的作用機制研究
　　目的：在前述研究建立的高血糖“代謝記憶”動物及細胞模型的基礎上，通過細胞轉染探究miR-146a和miR-484對NF-κB p65亞單位及前炎癥因子的作用機制。
　　方法：
　　1.通過轉染miR-146a mimics/inhi

8、bitors，上調(diào)或下調(diào)HAECs中miR-146a的表達，檢測預測靶基因蛋白表達水平、NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達水平。
　　2.通過轉染miR-484 mimics/inhibitors，上調(diào)或下調(diào)HAECs中miR-484的表達水平，檢測VEGFB、NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達水平。
　　3.通過轉染 VEGFB過表達質粒或 VEGFB siRNA，上調(diào)或下調(diào) HAECs

9、中VEGFB的表達，檢測NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達水平。
　　結果：
　　1.轉染miR-146a mimics后，HAECs中p65、MCP-1及IL-6的表達水平下降；轉染了miR-146a inhibitors，細胞內(nèi)p65、MCP-1及IL-6的表達水平上升。
　　2.上調(diào) miR-146a表達可使 IRAK1、TRAF6的表達水平下降；下調(diào) miR-146a表達后，IRAK1、TRA

10、F6的表達水平上升。
　　3.轉染miR-484 mimics后，HAECs中miR-484表達上升，p65、MCP-1及IL-6的表達水平下降；轉染miR-484 inhibitors，miR-484表達下降，NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達水平上升。
　　4.轉染 miR-484 mimics，HAECs中 VEGFB的表達水平下降；轉染 miR-484 inhibitors，VEGFB的表達水平上升

11、。
　　5.上調(diào)HAECs中VEGFB表達，NF-κB p65亞單位、MCP-1及IL-6的表達水平上升；下調(diào)VEGFB表達后細胞內(nèi)p65、MCP-1及IL-6的表達水平下降。
　　結論：
　　1.高血糖“代謝記憶”時miR-146a表達下降，并可通過其靶基因IRAK1和TRAF6來調(diào)節(jié)NF-κB p65及前炎癥因子的表達。
　　2.高血糖“代謝記憶”時 miR-484表達持續(xù)下降，并可通過其靶基因 VEGFB調(diào)