血管活性腸肽對(duì)急性肺損傷時(shí)肺內(nèi)TREM-1表達(dá)的影響及其機(jī)制.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury, ALI)及其嚴(yán)重形式急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是多種因素引起的臨床常見(jiàn)危重癥，而過(guò)度炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ALI/ARDS的主要原因，因此，抑制ALI/ARDS早期階段的“瀑布式”炎癥反應(yīng)可改善ALI/ARDS的預(yù)后。髓樣細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體-1(triggering receptorexpressed on myeloid

2、 cells-1，TREM-1)是表達(dá)于巨噬細(xì)胞和中粒細(xì)胞等髓樣細(xì)胞表面的免疫球蛋白超家族受體，研究表明TREM-1可放大TLR4介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。血管活性腸肽(vasoactive intestinalpeptide，VIP)是肺內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)肽之一。本室前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)VIP可抑制TNF-α等炎癥因子的表達(dá)而呈現(xiàn)出抑炎特性。VIP對(duì)ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1表達(dá)有無(wú)影響尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的:
　　 觀(guān)察

3、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1的表達(dá)及VIP的調(diào)控。
　　 方法:
　　 1.采用LPS復(fù)制ALI小鼠動(dòng)物模型，RT-PCR法檢測(cè)肺內(nèi)TREM-1mRNA表達(dá);氣管注射VIP慢病毒觀(guān)察肺內(nèi)高表達(dá)VIP對(duì) ALI時(shí)小鼠TREM-1 mRNA表達(dá)的影響;
　　 2.給予靜息狀態(tài)的小鼠巨噬細(xì)胞不同濃度的VIP和不同的作用時(shí)間，RT-PCR法檢測(cè)TREM-1 mRNA表達(dá);進(jìn)一步以L(fǎng)PS應(yīng)激小鼠巨噬細(xì)胞

4、，給予不同濃度的VIP預(yù)處理和不同的作用時(shí)間，采用RT-PCR法檢測(cè)TREM-1 mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TREM-1蛋白表達(dá)。NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理后觀(guān)察LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-1的表達(dá)。VIP預(yù)處理后Western Blot檢測(cè)LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞中I-κB的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.VIP對(duì)ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1 mRNA表達(dá)的影響
　　 ALI動(dòng)物模型復(fù)制成功后，采用RT-

5、PCR檢測(cè)ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示:LPS經(jīng)腹腔注射6h后即可檢測(cè)到小鼠肺內(nèi)TREM-1mRNA的表達(dá)顯著增加。經(jīng)氣管注射VIP慢病毒觀(guān)察肺內(nèi)高表達(dá)VIP對(duì)ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示:與GFP+LPS組相比（0.630±0.039），VIP可降低ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1 mRNA的表達(dá)（0.531±0.027，P＜0.05）。
　　 2.VIP對(duì)LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞T

6、REM-1表達(dá)的影響
　　 2.1 VIP對(duì)靜息狀態(tài)的小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)的影響
　　 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示:VIP（10-8M）預(yù)處理不同時(shí)間后(2、4、6、12和24 h)或不同濃度的VIP（10-10、10-9、10-8和10-7 M）預(yù)處理后，小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯變化（圖3，圖4，P＞0.05）。
　　 2.2VIP對(duì)LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1

7、 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)顯示:LPS處理3h后即可檢測(cè)到小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1mRNA表達(dá)明顯增加(0.062±0.005)，且LPS處理6h后達(dá)峰值（0.107±0.015，P＜0.05）。采用不同濃度的LPS(0.04、0.2、1、5和25μg/ml)應(yīng)激小鼠巨噬細(xì)胞，可見(jiàn)隨著LPS濃度升高，小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)逐漸增加;當(dāng)LPS濃度為1μg/ml時(shí)，小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)最高（0.1

8、65±0.015，P＜0.05）。
　　 RT-PCR檢測(cè)顯示:與VIP預(yù)處理2 h LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)（0.364±0.018）相比，VIP(10-8 M)預(yù)處理6h表達(dá)明顯減少(0.251±0.008)，VIP預(yù)處理12 h表達(dá)最低（0.178±0.006），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。采用不同濃度的VIP(10-10、10-9、10-8和10-7 M)預(yù)處理LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞，

9、可見(jiàn)隨著VIP濃度升高，小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)逐漸減少;當(dāng)VIP濃度為10-7 M時(shí)，小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)最低（0.249±0.010，P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示:LPS（1μg/ml）可增加小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1蛋白表達(dá)(117.46±6.225，P＜0.05)，而VIP(10-8M)可降低TREM-1蛋白表達(dá)（90.89±3.635，P＜0.05）。
　　 3.VIP抑制LPS應(yīng)激

10、的小鼠巨噬細(xì)胞NF-κB活化
　　 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:PDTC可顯著性地抑制LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞TREM-1 mRNA的表達(dá)（0.135±0.009，P＜0.05）。進(jìn)一步采用Western Blot檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞中I-κB的含量來(lái)反映NF-κB的活化，結(jié)果顯示:VIP對(duì)靜息狀態(tài)的小鼠巨噬細(xì)胞中I-κB的表達(dá)無(wú)明顯影響（P＞0.05）;與LPS處理組（0.186±0.022）相比，VIP+LPS組小鼠巨噬細(xì)胞I-κ