蛋白激酶G在鈣化血管中的作用.pdf

1、目的：骨、牙齒之外的非骨性組織發(fā)生鈣化，伴或不伴組織壞死或損傷，均稱為異位鈣化。心血管系統(tǒng)的異位鈣化常見于老年人及高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病和慢性腎病患者，包括動脈內(nèi)膜（動脈粥樣硬化相關(guān)鈣化）、動脈中層（Mo"nckeberg's sclerosis）和心臟瓣膜鈣化，無論發(fā)生在哪個部位，都會引起血流動力學(xué)和機(jī)械力學(xué)的改變，使動脈管壁僵硬，收縮壓升高、舒張壓降低，脈壓差增大，冠狀動脈灌注降低，最終將導(dǎo)致左室肥大、心肌缺血和心律失常，并增

2、加卒中和猝死的危險。血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病、衰老、高血壓等多種疾病的病理生理基礎(chǔ)，是心血管疾病的主要危險因子，出現(xiàn)在80％血管損傷和90％冠脈疾病中。較無鈣化者，任何程度的冠狀動脈鈣化整體相對危險度為4.3，3～5年冠心病事件（心肌梗死或心源性死亡）增加4倍。深入研究血管鈣化的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)血管鈣化的發(fā)生，具有重要的臨床意義。
　　 既往認(rèn)為血管鈣化是過飽和的鈣、磷在血管壁的被動沉積，近年證實(shí)是由細(xì)胞和

3、分子參與的、類似于骨形成的主動過程。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin，CaN）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，分類上屬于PP2B家族，是唯一受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶。CaN主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，組織分布廣泛，通過使底物活化T細(xì)胞核因子（Nuclear factor of activated T cells，NFATs）去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶（cGMP-dep

4、endent protein kinase，PKG）是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，存在于多種組織細(xì)胞，是重要的信號分子NO的下游底物，能夠在多種水平調(diào)節(jié)Ca2+水平，從而參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。近年研究已證實(shí)CaN能夠抑制培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）胞漿內(nèi)PKG I的表達(dá)，而CaN在鈣化血管中與PKG的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未見有報道。
　　 本試驗(yàn)采用華法令和維生素D3建立大鼠血管鈣化模型，測定主動脈CaN mR

5、NA、蛋白質(zhì)的表達(dá)與活性及PKG mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)，并觀察CaN對PKG表達(dá)的影響，初步探討CaN及PKG對血管鈣化的調(diào)節(jié)作用，為血管鈣化的臨床防治提供新的思路。
　　 方法：4w SD雄性大鼠36只，體重80～90g，隨機(jī)分為3組，每組12只。A組：對照組；B組：鈣化組；C組：環(huán)孢霉素A組；實(shí)驗(yàn)第1－8天，各組均給予維生素K115mg·kg-1·d-1，皮下注射。同時，C組另給予環(huán)孢霉素A10mg·kg-1·d-1腹腔注

6、射；A組和B組分別給予等量生理鹽水腹腔注射。第3天開始，B、C組另給予維生素D33×105U·kg-1·d-1，皮下注射，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第5天，同時給予華法令15mg·100g-1，12h一次，皮下注射，持續(xù)至第8天；對照組在相同時間給予等量生理鹽水皮下注射。實(shí)驗(yàn)第9天，所有動物麻醉后處死。開胸，暴露出心臟，分離胸主動脈，并向下剖開腹部，分離出腹主動脈，從主動脈根部至腹主動脈分叉處剪下主動脈。取材后每組各取6只以免疫組化法測定CaNB1蛋白

7、及PKGⅠ。蛋白，原位雜交法測定CaNAα mRNA及PKGⅠ。mRNA；6只用于CaN和堿性磷酸酶（ALP）活性測定。將免疫組織化學(xué)和原位雜交結(jié)果應(yīng)用Image-Pro Plus圖象分析軟件，分別計算各組主動脈組織相同面積內(nèi)陽性細(xì)胞的累積光密度值（integrated optic density，IOD）。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，首先對計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，組間資料比較應(yīng)用單

8、因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，p<0.05即有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）HE染色結(jié)果示對照組大鼠主動脈壁結(jié)構(gòu)完整，中層血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）排列整齊；鈣化組和環(huán)孢霉素A組大鼠主動脈中層VSMCs排列紊亂，彈力纖維迂曲斷裂。VonKossa染色示鈣化組大鼠主動脈中層彈性纖維間有大量黑色顆粒沉積；環(huán)孢霉素A組大鼠主動脈中層彈性纖維間亦可見黑色顆粒沉積；對照組未見明顯黑色顆粒沉積。（2）免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示三組

9、大鼠主動脈可見一定量CaNB1蛋白及PKGⅠ。蛋白表達(dá)，主要位于胞漿內(nèi)。鈣化組與對照組對比：鈣化組大鼠主動脈CaNB1蛋白（8731.93±469.92）較對照組（5500.95±982.57）表達(dá)明顯增加（p<0.01），PKGⅠα蛋白（2305.108±628.08001）較對照組（4960.409±911.34036）表達(dá)明顯減少（p<0.01）；CsA組與對照組對比：CsA組大鼠主動脈CaNB1蛋白（7712.79±539.20

10、）較對照組（5500.95±982.57）表達(dá)明顯增加（p<0.01），PKGⅠα蛋白（7889.977±850.80532）較對照組（4960.409±911.34036）表達(dá)也明顯增加（p<0.01）；CsA組與鈣化組對比：CsA組大鼠主動脈CaNB1蛋白（7712.79±539.20）較鈣化組（8731.93±469.92）表達(dá)減少（p<0.05），PKGⅠα蛋白（7889.977±850.80532）較鈣化組（2305.108±

11、628.08001）表達(dá)明顯增加（p<0.01）。（3）原位雜交結(jié)果顯示三組大鼠主動脈可見CaNAα mRNA及PKGⅠαmRNA表達(dá)，主要位于胞漿中。鈣化組與對照組對比：鈣化組大鼠主動脈CaNAαmRNA（26420.97±1697.97）較對照（10302.17±2636.06）表達(dá)明顯增加（p<0.01），PKGⅠαmRNA（5773.905±642.80153）較對照組（8713.067±740.37046）表達(dá)明顯減少（p<0

12、.01）；CsA組與對照組對比：CsA組大鼠主動脈CaNAαmRNA（16775.25±4029.59）較對照組（10302.17±2636.06）表達(dá)明顯增加（p<0.01），PKGⅠαmRNA（11043.72±971.89608）較對照組（8713.067±740.37046）表達(dá)也明顯增加（p<0.01）；CsA組與鈣化組對比：CsA組大鼠主動脈CaNAα mRNA（16775.25±4029.59）與鈣化組（26420.97±

13、1697.97）比較表達(dá)明顯減少（p<0.01），PKGⅠαmRNA（11043.72±971.89608）較鈣化組（5773.905±642.80153）表達(dá)明顯增加（p<0.01）。（4）鈣化組 CaN活性（1.53±0.29μmolPi·mgprot-1·h-1）較對照組（0.90±0.39μmolPi·mgprot-1·h-1明顯增加（p<0.01）；CsA組CaN活性（1.54±0.40μmolPi·mgprot-1·h-1）

14、較對照組（0.90±0.39μmolPi·mgprot-1·h-1）明顯增加（p<0.01）；CsA組CaN活性（1.54±0.40μmolPi·mgprot-1·h-1）與鈣化組（1.53±0.29μmolPi·mgprot-1·h-1）比較無顯著性差異（p>0.05）。（5）鈣化組ALP活性（463.38±65.09U·gprot-1）較對照組（360.04±49.01U·gprot-1）增加（p<0.05）； CsA組 ALP活性

15、（479.78±74.67U-1gprot）較對照組（360.04±49.01 U·gprot-1）明顯增加（p<0.01），與鈣化組（463.38±65.09U·gprot-1）比較無顯著性差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)采用華法令和維生素D3皮下注射成功地建立了大鼠主動脈鈣化模型。2.本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)鈣化大鼠主動脈中CaN mRNA和蛋白的表達(dá)和活性明顯增加時，PKG mRNA和蛋白的表達(dá)明顯減少，說明在鈣化血管