高級(jí)蛋白氧化產(chǎn)物在血管鈣化中的作用及其機(jī)制探討.pdf_第1頁
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1、第一部分:尿毒癥患者高級(jí)蛋白氧化產(chǎn)物與血管鈣化的關(guān)系 背景:血管鈣化是慢性腎臟病(CKD)患者心血管事件發(fā)生率和死亡率增加的重要危險(xiǎn)因素。氧化應(yīng)激在尿毒癥患者中十分常見,能夠預(yù)計(jì)總體和心血管的死亡率。高級(jí)蛋白氧化產(chǎn)物(AOPP)是近年來發(fā)現(xiàn)的氧化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷的重要標(biāo)志物。本研究探討CKDV期患者血中水平及其與動(dòng)脈鈣化的關(guān)系。 方法: 入選50例CKDV期患者,在行動(dòng)靜脈內(nèi)瘺術(shù)中取部分橈動(dòng)脈;同期lO例年齡相匹

2、配的胸外科胸腺瘤患者,在術(shù)中選取同級(jí)別的胸廓內(nèi)動(dòng)脈作對(duì)照。茜素紅染色測(cè)定鈣鹽沉積。免疫組織化學(xué)方法測(cè)定骨特異性蛋白——骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)。H.E.染色測(cè)定內(nèi)膜中層厚度(IMT)、管壁/管腔比值。測(cè)定血清AOPP、鈣、磷、iPTH水平。 結(jié)果: CKDV期患者血清AOPP水平(90.22±55.88)umol/L明顯高于健康對(duì)照者(35.79±4.31)umol/L(P<0.01)。50例橈動(dòng)脈標(biāo)本中發(fā)生血管鈣化的有

3、24例,發(fā)生率為48%,均發(fā)生在血管中膜,對(duì)照組均無鈣化發(fā)生。50例橈動(dòng)脈標(biāo)本中44例中膜有OPN的陽性沉積(88%),其中24例鈣化的橈動(dòng)脈中膜均有OPN表達(dá),26例無明顯鈣化的標(biāo)本中也有20例(76.9%)中膜有OPN的表達(dá)。對(duì)照組無OPN陽性沉積。24例有動(dòng)脈鈣化者血清AOPP水平(122.52±66.9umol/L)明顯高于26例無動(dòng)脈鈣化者(61.29±31.23umol/L)(P<0.01)。Pearson相關(guān)分析顯示血清A

4、OPP水平與血管鈣化程度(r=0.791,P<0.001)、橈動(dòng)脈IMT(r=0.691,P<0.001)及橈動(dòng)脈管壁/管腔比值(r=0.354,P<0.05)呈正相關(guān)。血管鈣化程度與AOPP(r=0.791,P<0.001)、血清磷(r=0.602,P<0.01)、血iPTH水平(r=0.549,P<0.05)呈正相關(guān)。 結(jié)論: CKDV期患者普遍存在高AOPP血癥和血管鈣化,血漿AOPP水平與血管鈣化密切相關(guān)。

5、 第二部分、AOPP促進(jìn)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和鈣化 背景:本文第一部分研究表明尿毒癥患者血AOPP與動(dòng)脈鈣化密切相關(guān)。但血AOPP水平升高僅僅是氧化應(yīng)激的伴隨現(xiàn)象,還是參與了尿毒癥狀態(tài)下動(dòng)脈鈣化的發(fā)生發(fā)展呢?近年來已明確血管鈣化是一種類似于骨和軟骨形成的主動(dòng)調(diào)節(jié)過程,伴隨著血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,出現(xiàn)“骨樣”蛋白,如骨橋蛋白、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原等。有研究表明氧化應(yīng)激(如MM-LDL、過氧

6、化氫或黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶等)能夠促進(jìn)血管細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。因此本試驗(yàn)是將AOPP直接作用于體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC),觀察其是否有直接導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,進(jìn)而促進(jìn)血管鈣化的作用。 方法: 將人血清白蛋白(HSA)用濃次氯酸處理,制備AOPP-HSA,并測(cè)定其濃度。將AOPP-HSA作用于培養(yǎng)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC),同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組和單純HSA組(其蛋白濃度與AOPP-HSA

7、中的蛋白濃度一致)。Real-time PCR測(cè)定干預(yù)各組72h后細(xì)胞的核結(jié)合因子α(cbfα)和骨橋蛋白(OPN)水平。Western blot方法測(cè)定各組干預(yù)14天后OPN和平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白α(SM-α-actin)的蛋白表達(dá)。各組干預(yù)14天后用濃鹽酸脫鈣,測(cè)定上清液的鈣濃度,用細(xì)胞蛋白含量標(biāo)化鈣含量。 結(jié)果: 干預(yù)72h后,Real-time PCR結(jié)果提示與對(duì)照組相比,AOPP能明顯增加HASMC的cbf-α(

8、16.03±0.45 vs.1.06±0.43,P<0.001=和OPN(4.62±0.34 vs.1.06±0.43,P<0.01=表達(dá),而單純HSA組cbfα-1(1.05±0.06 vs.1.06±0.43)和OPN(0.96±0.08 vs.1.06±0.43)的表達(dá)與對(duì)照組無明顯差別。干預(yù)14天后,Western blot結(jié)果提示AOPP能明顯誘導(dǎo)HASMC的OPN的表達(dá),使SM-α-actin的表達(dá)明顯減少,而單純HSA無此

9、作用。14天后AOPP-HSA組HSAMC的鈣沉積明顯高于對(duì)照組(42±2.65 vs.4.23±0.21,P<0.001),單純HSA組與對(duì)照組相比其HASMC的鈣沉積則無明顯變化(4.3±0.35 vs.4.23±0.21,P>0.05)。 結(jié)論: AOPP直接作用能使HASMC明顯降低了平滑肌細(xì)胞標(biāo)志性蛋白SM-α-actin的表達(dá),明顯增加HASMC成骨細(xì)胞標(biāo)志性蛋白OPN的表達(dá),明顯增加HASMC的cbfα的表

10、達(dá),使HASMC向成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)HASMC鈣化。 第三部分、AOPP可能通過氧化應(yīng)激和激活ERK通路促進(jìn)平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和促進(jìn)鈣化 背景:本部分進(jìn)一步探討AOPP介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和促進(jìn)鈣化的可能機(jī)制。近來的研究提示AOPP不僅是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物,它本身也可能誘導(dǎo)或加重氧化應(yīng)激。因此我們探討AOPP是否通過氧化應(yīng)激而促進(jìn)HASMC的轉(zhuǎn)分化。另外,分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated

11、 protein kinase,MAPK)家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,特別是其中的ERKl,2途徑,主要介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。且有研究表明MAPK的激活還能促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本部分還研究AOPP是否通過激活MAPK通路促進(jìn)平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。 方法: AOPP-HSA分別干預(yù)HASMC 2h,4h,6h,8h,12h,16h,24h,48h,72h,以氧化敏感的熒光材料2'-7’-二氯熒光素雙醋酸

12、鹽(DCFH-DA)染色,用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的氧化水平。HASMC用維生素E預(yù)孵育后再予AOPP作用6h,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的氧化水平,AOPP干預(yù)14天后用Western blot測(cè)定骨橋蛋白(OPN)的表達(dá),并測(cè)定細(xì)胞的鈣含量。AOPP-HSA分別干預(yù)HASMC 10min,20min,30min,40min,50min,60min,Western blot方法測(cè)定p44/42 MAPK,phospho-p44/42MAPK,SAPK/

13、JNK,phospho-SAPK/JNK,p38MAPK,phospho-p38MAPK的蛋白表達(dá)。HASMC用MEKl抑制劑PD98059預(yù)孵育后再予AOPP作用14d,Westernblot測(cè)定骨橋蛋白(OPN)的表達(dá),并測(cè)定細(xì)胞的鈣含量。 結(jié)果: AOPP-HSA孵育HASMC2h后,細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度開始升高,約在6h達(dá)到高峰。單純HSA、AOPP-HSA和維生素E預(yù)孵育+AOPP組分別干預(yù)HASMC6h后,HS

14、A對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化水平無明顯影響,AOPP.HSA明顯增加細(xì)胞內(nèi)的氧化水平,維生素E預(yù)孵育后再予AOPP-HSA干預(yù),細(xì)胞內(nèi)氧化水平明顯降低。維生素E預(yù)孵育能使AOPP-HSA誘導(dǎo)的HASMC表達(dá)OPN明顯減少(P<0.01),鈣沉積明顯減少(20±1.00 vs.42±2.65 ug/mg蛋白,P<0.01)。AOPP能夠明顯的激活phospho-ERK。PD98059預(yù)孵育能使AOPP-HSA誘導(dǎo)的HASMC的OPN表達(dá)明顯降低(P<0

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