阿托伐他汀及其誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞疫苗治療神經(jīng)免疫性疾病的潛能研究.pdf

1、研究背景:實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(Experimentalautoimmuneneuritis，EAN)是一種主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的、累及外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheralnervoussystem，PNS)的急性炎癥性脫髓鞘性疾病，是目前公認(rèn)的研究人類格林-巴利綜合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)的理想動物模型。通過免疫同種抗原可以在易感動物中成功地誘導(dǎo)EAN的發(fā)生。
　　 他汀類藥物是3-羥基-

2、3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的抑制劑，可以通過甲羥戊酸途徑抑制膽固醇的生物合成，在臨床上主要用于治療高膽固醇血癥。目前越來越多的研究表明他汀類藥物具有免疫調(diào)節(jié)的作用。而且他汀類藥物的免疫調(diào)節(jié)作用是多效的，如可以抑制T細(xì)胞的活化、增殖和遷移等，并且越來越受到人們的關(guān)注。研究報道稱，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE）中，阿托伐他汀能夠促進T細(xì)胞反應(yīng)從促炎的T

3、hl型向抗炎的Th2型轉(zhuǎn)化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在自身免疫性疾病的發(fā)展中起著重要的作用。在復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化的病人中，辛伐他汀能夠直接抑制CD4+T細(xì)胞中IL-17的分泌。由此可見，在自身免疫性疾病中他汀類藥物可以抑制Th1和Th17型細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。除此以外，他汀類藥物還可以抑制抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentingcells,APCs)如樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞的成熟和功能。阿托伐他汀或洛伐他汀能夠抑制人類樹突狀細(xì)胞表

4、面共刺激分子如CD40、CD83、CD86和人類白細(xì)胞相關(guān)抗原-DR(humanleukocyteantigen-DR,HLA-DR)的表達(dá)，進而降低其誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力。他汀類藥物還可以抑制經(jīng)IFN-γ刺激的人類巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)的表達(dá)，同時還能降低這些細(xì)胞活化T細(xì)胞的能力。另外，阿托伐他汀還能夠增加人類外周血單個核細(xì)胞中CD4+CD25

5、high和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量。
　　 綜上所述，他汀類藥物在動物及人類自身免疫性疾病中有了一定的研究，但到目前為止，還沒有關(guān)于阿托伐他汀對EAN或人類GBS免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報道。基于之前的研究，我們推測阿托伐他汀可以通過免疫調(diào)節(jié)作用進而改善EAN大鼠的臨床癥狀。因此，我們在EAN大鼠發(fā)病的起始階段開始給予阿托伐他汀治療，并探討其對EAN大鼠免疫調(diào)節(jié)作用的機制。
　　 研究目的:探討阿托伐他汀誘導(dǎo)實

6、驗性自身免疫性神經(jīng)炎免疫耐受的機制。
　　 研究方法:
　　 1.EAN模型的建立及臨床評分
　　 采用健康、雌性Lewis大鼠，將BPM溶于H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑中，雙后足墊皮下注射免疫大鼠，每只大鼠用量為200μl。注射當(dāng)天定為0天，采用雙盲法觀察，每日稱重并觀察大鼠的癥狀進行臨床評分，直至免疫后第18天。
　　 2.阿托伐他汀治療EAN大鼠
　　 將大鼠隨機分為10mg/

7、kg治療組、1mg/kg治療組和DMSO對照組。治療組于免疫后第5天開始每天腹腔注射不同劑量的阿托伐他汀溶液，直至免疫后第18天。對照組給予腹腔注射相同體積的DMSO。
　　 3.組織病理學(xué)檢測
　　 處死大鼠后取坐骨神經(jīng)，10％多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，依次經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染色、0.5％伊紅液染色、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞的浸潤情況并計數(shù)。
　　 4.免疫組化檢測
　　

8、 大鼠坐骨神經(jīng)石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟、水化，EDTA抗原修復(fù)，3％H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加兔抗大鼠IFN-γ抗體和兔抗大鼠IL-17抗體4℃過夜。洗滌后滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察大鼠坐骨神經(jīng)中陽性細(xì)胞的情況并計數(shù)。
　　 5.淋巴結(jié)單個核細(xì)胞(mononuclearcells，MNC)的制備
　　 大鼠麻醉后，無菌條件下取出EAN大鼠腹股溝

9、淋巴結(jié)，在無菌濾網(wǎng)上研磨制備成MNC懸液并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個細(xì)胞/ml。
　　 6.淋巴結(jié)MNC表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ的流式檢測
　　 取制備好的MNC懸液，分別加入PE標(biāo)記的CD80抗體、FITC標(biāo)記的CD86和MHC-Ⅱ單克隆抗體，混勻后4℃條件下孵育30min，洗滌后流式分析測定MNC表面不同分子的表達(dá)情況。
　　 7.流式檢測Treg細(xì)胞的情況
　　 取制備好的淋巴結(jié)MN

10、C懸液，加入FITC標(biāo)記的CD4抗體和PE標(biāo)記的CD25抗體4℃下孵育30min。洗滌后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)并混勻，4℃下避光孵育過夜。洗滌細(xì)胞后加入PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3抗體4℃孵育30min。重懸細(xì)胞后上機檢測。
　　 8.ELISA測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平
　　 經(jīng)BPM刺激的淋巴結(jié)MNC培養(yǎng)60h后，留取上清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作檢測

11、細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17的表達(dá)水平。
　　 9.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS17.0軟件對資料進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析(one-factoranalysisofvariance，ANOVA)進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation，SD)表示。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.各組大鼠的發(fā)病情況與臨床評分
　　 與對照組相比，

12、阿托伐他汀10mg/kg和1mg/kg治療均延遲了EAN大鼠的發(fā)病時間，而且明顯地改善了高峰期EAN大鼠的臨床癥狀。而且10mg/kg治療組和對照組EAN大鼠的發(fā)病起始時間相比具有明顯差異。從免疫后第13天到17天，與DMSO對照組相比，10mg/kg治療組的大鼠顯示了更低的臨床評分，1mg/kg治療組的大鼠也顯示了較低的臨床評分，但僅在免疫后第16天其臨床評分與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2.各組大鼠坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞浸

13、潤的情況
　　 與DMSO對照組相比，10mg/kg治療組和1mg/kg治療組大鼠坐骨神經(jīng)中均可見較少的炎性細(xì)胞。另外，10mg/kg治療組與1mg/kg治療組相比坐骨神經(jīng)中可見更少的炎性細(xì)胞浸潤。
　　 3.阿托伐他汀抑制了EAN大鼠坐骨神經(jīng)中IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生
　　 與DMSO對照組相比，10mg/kg治療組和1mg/kg治療組大鼠坐骨神經(jīng)中IFN-γ+和IL-17+細(xì)胞數(shù)量均明顯降低了。10mg/

14、kg治療組和1mg/kg治療組相比，坐骨神經(jīng)中IFN-γ+細(xì)胞的數(shù)量無明顯差異。而10mg/kg治療組大鼠坐骨神經(jīng)中比1mg/kg治療組大鼠坐骨神經(jīng)中可見更少的IL-17+細(xì)胞。進一步的分析表明，10mg/kg治療組和1mg/kg治療組大鼠坐骨神經(jīng)中IFN-γ+和IL-17+細(xì)胞分別占炎性細(xì)胞的百分比均明顯地低于DMSO對照組，而10mg/kg治療組和1mg/kg治療組之間卻沒有明顯差異。
　　 4.各組大鼠淋巴結(jié)MNC表面CD

15、80、CD86和MHC-Ⅱ分子的表達(dá)情況
　　 與DMSO對照組相比，10mg/kg治療組和1mg/kg治療組均明顯的低表達(dá)CD80，但10mg/kg治療組和1mg/kg治療組之間CD80的表達(dá)沒有明顯差異。另外，CD86和MHC-Ⅱ分子的表達(dá)在三組之間沒有明顯差異。
　　 5.各組大鼠淋巴結(jié)MNC中Treg細(xì)胞的表達(dá)情況
　　 結(jié)果顯示，與DMSO對照組相比，10mg/kg治療組和1mg/kg治療組均上調(diào)了CD

16、4+細(xì)胞中CD25+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量。但是兩個治療組之間卻沒有明顯差異。
　　 6.阿托伐他汀對細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17的影響
　　 與對照組相比，10mg/kg治療組和1mg/kg治療組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平明顯的降低了。IL-17的表達(dá)在三組之間沒有明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.阿托伐他汀可以誘導(dǎo)EAN的免疫耐受。
　　 2.阿托伐他汀誘導(dǎo)EAN免疫耐受

17、的機制主要是通過抑制Th1/Th17的應(yīng)答、抑制淋巴結(jié)MNC表面共刺激分子的表達(dá)及上調(diào)Treg細(xì)胞的功能來實現(xiàn)的。
　　 3.阿托伐他汀對EAN大鼠的保護作用是劑量依賴性的。
　　 意義:
　　 本研究通過給予EAN大鼠腹腔注射不同劑量的阿托伐他汀溶液，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能夠誘導(dǎo)EAN的免疫耐受，且這種作用主要是通過抑制Th1/Th17的應(yīng)答、抑制淋巴結(jié)MNC表面共刺激分子的表達(dá)、上調(diào)Treg細(xì)胞的功能來實現(xiàn)的。而且