uPA通過TEM8誘導EGFR磷酸化的研究.pdf

1、近年來，靶向破壞腫瘤脈管系統(tǒng)在腫瘤生物學和治療學領域上受到眾多研究人員的關注。腫瘤血管化提供腫瘤持續(xù)的發(fā)生發(fā)展所必需的氧及營養(yǎng)物質。同時腫瘤通過血管獲得潛在的遷移能力，并且由此能夠緩解其無限增殖導致的低氧環(huán)境。血管發(fā)生則是促血管生成蛋白的產(chǎn)生導致現(xiàn)存的脈管萌發(fā)并在循環(huán)回復中使內皮細胞形成新的脈管網(wǎng)絡。若這種血管發(fā)生受到抑制或改變，腫瘤則無法從新生脈管系統(tǒng)中得到營養(yǎng)的供給，那么這些腫瘤組織將會饑餓而死。于是，靶向脈管生成而治療腫瘤的發(fā)生發(fā)

2、展顯得尤為重要。同時這些脈管網(wǎng)絡受腫瘤微環(huán)境影響，導致多種蛋白表達改變。經(jīng)過一系列的分子技術探究得到一些集中過表達的蛋白，其中較為特別的就是腫瘤內皮標志物8(TEM8)，其在多種腫瘤血管中高表達。
　　TEM8是Ⅰ型跨膜蛋白，在胚胎細胞及腫瘤脈管系統(tǒng)中高表達，并且在種間高度保守，能夠促進腫瘤相關的血管生成，并作為PA（炭疽毒素保護性抗原）的受體介導炭疽毒素進入宿主細胞，但其確切的生理功能還未能明確。一些研究發(fā)現(xiàn)，TEM8促進腫瘤細

3、胞的遷移和粘附，并在腫瘤血管生成中發(fā)揮關鍵性作用。在體外研究中得知，TEM8在多種內皮細胞的功能中具有重要作用，其胞外區(qū)能夠結合細胞外基質蛋白，同樣也能夠結合炭疽毒素保護性抗原。在臨床樣本及研究中均顯示TEM8在腫瘤內皮細胞中過表達，而在正常成熟組織中，TEM8的表達零星不規(guī)則并且遠遠低于腫瘤內皮組織。這些發(fā)現(xiàn)均暗示了在成熟細胞內TEM8高表達往往是由于異常的脈管生成，如腫瘤脈管系統(tǒng)，所以可以將TEM8作為靶向腫瘤內皮組織的治療靶點。<

4、br>　　TEM8具有三種天然突變體，其中IsoformⅠ具有563個氨基酸殘基，包括320個氨基酸的胞外區(qū)、23個氨基酸的跨膜區(qū)以及221個氨基酸殘基的胞內區(qū)。其胞內區(qū)具有14個潛在的磷酸化位點以及一個富含脯氨酸的C端胞質區(qū)。其中TEM8的胞外區(qū)主要由包含一個金屬離子結合位點(MIDAS)的vWA結構域組成，同時也是TEM8胞外蛋白質間相互作用的區(qū)域，其與integrin（整聯(lián)蛋白）的1結構域具有很高的同源性，故推測其生理功能可能與i

5、ntegrin相似。有報道稱uPA能夠通過結合integrin、EGFR等促使細胞遷移粘附及增殖。
　　本課題組在前期工作中，構建并表達了一種抗體樣分子——TEM8-Fc(TEM8胞外區(qū)的vWA結構域和IgG1 Fc段組成的融合蛋白)，發(fā)現(xiàn)其具有抗血管生成能力，并能夠抑制多種腫瘤細胞的生長、遷移及血管生成，然而其抗腫瘤機制并不十分清楚。在實驗室前期實驗中，通過免疫共沉淀實驗得到TEM8新的生理性配體——uPA，并證明其與TEM8間

6、具有一定的相互作用，同時TEM8在動物模型中具有一定的抗腫瘤作用。故本實驗設想uPA與TEM8及EGFR可以發(fā)生相互作用，導致EGFR磷酸化并激活下游信號通路，故可將TEM8作為抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的靶點。
　　為了驗證TEM8能夠結合uPA、EGFR并實現(xiàn)其相應的生理功能，首先進行TEM8-Fc蛋白的制備，并進一步進行ELISA、基因沉默、免疫沉淀、流式細胞分析等實驗，并結合實驗室前期工作，說明uPA與TEM8具有一定的相互作用。流式

7、細胞分析結果表明野生型CHO-K1能夠結合PE標記的uPA，而TEM8缺陷型CHO-Pr230并不能結合uPA，說明uPA結合至CHO細胞表面依賴于TEM8的表達。基因沉默實驗結果表明，在HepG2和CHO細胞中TEM8蛋白沉默大大降低了細胞對uPA的結合能力，從而說明TEM8可作為uPA除uPAR外的另一個受體。免疫沉淀實驗證明TEM8與uPA之間具有一定的相互作用，且具有劑量依賴性。用純化的TEM8-Fc蛋白與uPA之間進行非競爭性

8、ELISA，結果顯示uPA與TEM8結合力較強，結合常數(shù)為1×107。同時，在uPA刺激下進行免疫熒光實驗，結果顯示uPA刺激下TEM8與EGFR發(fā)生共定位現(xiàn)象，說明uPA能夠促進TEM8與EGFR間相互作用。
　　在上述實驗基礎上，對EGFR磷酸化進行研究。在EGF、uPA的刺激下，探索EGFR的磷酸化位點及磷酸化水平。實驗室前期磷酸化芯片結果顯示，uPA能夠使EGFR Y1173位、Y845位磷酸化位點的磷酸化水平上調。為了了

9、解uPA刺激下EGFR的磷酸化中TEM8的作用，首先在TEM8、EGFR高表達的細胞系HepG2細胞中研究EGF、uPA刺激下EGFR的磷酸化作用。綜合對EGFR Y845、Y992、 Y1045、Y1068、Y1086、Y1173等磷酸化位點的磷酸化水平研究，磷酸化WB結果證明uPA能夠上調EGFR Y1173、Y845位的磷酸化水平，尤其顯著上調Y845位磷酸化位點，說明uPA能夠增強EGFR的磷酸化作用。其次，構建TEM8、EGF

10、R過表達細胞系，選取TEM8、EGFR均低表達的HEK293F細胞，穩(wěn)定轉染得到TEM8/EGFR共表達的細胞系TEM8-EGFR/HEK293F，通過對TEM8-EGFR/HEK293F與EGFR/HEK293F細胞系EGFR磷酸化水平的比較，以此確定TEM8在uPA刺激EGFR磷酸化中的促進作用。
　　在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)在uPA、EGF的刺激下，TEM8有入核現(xiàn)象，即刺激致使TEM8蛋白進入核內發(fā)生一定的生理作用。為探索TEM

11、8入核是否為其正常生理功能，以及入核實現(xiàn)何種生理功能，進行了以下實驗。免疫熒光層掃實驗證明，在EGF刺激10min、uPA刺激15 min后TEM8有明顯的入核現(xiàn)象。為進一步確定其入核，我們將TEM8高表達的HepG2細胞進行核質分離，實驗證明EGF、uPA的刺激能夠明顯提高TEM8在細胞核內的含量，同時細胞質中TEM8的含量相應減少，提示刺激發(fā)生后TEM8可能有入核現(xiàn)象。
　　綜合上述實驗結果表明，TEM8作為integrin類