Aurora-A誘導BRCA2磷酸化及其與癌癥的關(guān)系研究.pdf

1、學校代碼：10270分類號：Q95學號：142200786碩士學位論文AuraA誘導BRCA2磷酸化及其與癌癥的關(guān)系研究學院：生命與環(huán)境科學學院專業(yè)：動物學研究方向：動物細胞分子生物學研究生姓名：劉凱伊指導教師：萬平完成日期:2017.03.22摘要上海師范大學碩士學位論文I性對照）、AuraA與BRCA2兩對蛋白質(zhì)間體外磷酸化反應體系。最后成功在體外構(gòu)建了各體外純化蛋白、檢測出了適宜的磷酸化反應體系，并最終驗證出BRCA2受AuraA

2、在磷酸化體系中誘導后，于其序列靠近C端30643208位點之間的蘇氨酸(threoninethr)上發(fā)生磷酸化。本實驗包括以下四個部分：1BRCA2BRCA2的體外分段擴增的體外分段擴增本實驗首先運用PCR技術(shù)、以設計好的兩端帶有NotI和SalI兩個酶切位點（這兩個酶切位點載體上有而BRCA2片段上沒有）的16對引物將BRCA2以擴增的形式分成大小不等的16段。并將酶切后的16段BRCA2片段分別與酶切后的原核載體PGEX4T3連接，

3、讓其粘性末端結(jié)合，重新交叉重組，構(gòu)建重組原核質(zhì)粒。隨后以BL21原核桿菌為基因復制載體，運用轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段將16個重組質(zhì)粒導入原核細胞BL21中，并在適宜條件下培養(yǎng)促進重組質(zhì)粒在原核細胞中的大量復制。最后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在不同條件下誘導蛋白的表達，通過蛋白印跡法(westernblot)用GST抗體檢測16個PGEX4T3BRCA2fragment1~16重組質(zhì)粒在不同條件下表達的蛋白量，并篩選出最優(yōu)條件。通過以上實驗，

4、我們成功誘導表達出16個PGEX4T3BRCA2fragment1~1重組質(zhì)粒的蛋白，且為每一個片段找到了能表達最優(yōu)蛋白量的條件。2AuraAAuraA激酶誘導激酶誘導P53P53磷酸化磷酸化已有研究明確表明，AuraA會誘導P53蛋白于絲氨酸(serineser)315位點發(fā)生磷酸化，所以我們選擇AuraA與P53蛋白的磷酸化反應作為檢測磷酸化體系有效性的陽性對照。本實驗同樣用第一部分中的方法構(gòu)建了以PGEX4T3為載體的PGRX4T