EPAC2下調(diào)通過(guò)激活CDK5誘導(dǎo)Tau蛋白過(guò)度磷酸化.pdf

1、背景：
　　阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）是一種常見(jiàn)的、進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理學(xué)特征是腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）和細(xì)胞外的老年斑(SPs)的形成。NFTs的主要成分是過(guò)度磷酸化的 Tau。異常磷酸化的Tau喪失促微管組裝和穩(wěn)定微管的功能,并聚集成為成對(duì)螺旋絲（PHF），最終導(dǎo)致NFTs的形成、突觸的退變和神經(jīng)元的丟失,在AD的病程發(fā)生、發(fā)展中起了關(guān)鍵作用。

2、>　　鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換蛋白（EPAC）作為cAMP直接激活的下游蛋白，在生物進(jìn)程調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。EPAC1/2敲除小鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶和社會(huì)交往的障礙，且EPAC2亞型在AD患者腦中mRNA水平表達(dá)下降，提示EPAC2下調(diào)參與AD的病程調(diào)節(jié)。然而EPAC2信號(hào)如何調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)通路，從而影響學(xué)習(xí)記憶尚不清楚。
　　目的：
　　探討EPAC2調(diào)節(jié)的信號(hào)通路對(duì)Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化的調(diào)控機(jī)制；探究如何逆轉(zhuǎn)EPAC2下調(diào)后帶來(lái)

3、的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　方法：
　　在探討EPAC2信號(hào)通路對(duì)Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化調(diào)控機(jī)制的研究中，我們應(yīng)用了EPAC2-/-轉(zhuǎn)基因小鼠和si-EPAC2質(zhì)粒，應(yīng)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)在整體水平和細(xì)胞水平分別檢測(cè) Tau蛋白磷酸化相關(guān)抗體的表達(dá)，并分離出可溶性和不可溶蛋白組分對(duì)Tau蛋白的溶解性進(jìn)行探討。為了驗(yàn)證是否有Tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)，我們進(jìn)行了Bielschowsky銀染。
　　為了探究造成上述結(jié)果的

4、機(jī)制，我們應(yīng)用免疫印跡反應(yīng)篩選了一系列與Tau蛋白磷酸化相關(guān)的激酶酯酶，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié) Tau蛋白磷酸化關(guān)鍵的激酶 CDK5被激活,再根據(jù)文獻(xiàn)研究找到 CDK5上游因子 Calpain并進(jìn)行活性檢測(cè)。為了解釋 EPAC2下調(diào)與Calpain的關(guān)聯(lián)性，應(yīng)用ELISA從多個(gè)免疫因子中最終篩選出TGFβ1這個(gè)EPAC2和Calpain的中間連接因子。
　　為了逆轉(zhuǎn)EPAC2下調(diào)帶來(lái)的Tau病變，我們應(yīng)用了Calpain抑制劑Calpain i

5、nhibitorⅣ和CDK5抑制劑Roscovitine腦立體定位注射到EPAC2-/-小鼠側(cè)腦室，用免疫印跡檢測(cè)是否對(duì)EPAC2下調(diào)導(dǎo)致的Tau過(guò)度磷酸化有修復(fù)作用。
　　結(jié)果：
　　1、EPAC2下調(diào)導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化，不可溶Tau蛋白增加、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成等Tau病變。
　　為了探討EPAC2下調(diào)對(duì)Tau蛋白的影響，我們首先應(yīng)用EPAC2-/-轉(zhuǎn)基因小鼠和si-EPAC2質(zhì)粒在動(dòng)物和細(xì)胞水平造成EPAC2下

6、調(diào)的環(huán)境，再取樣分析Tau蛋白的磷酸化程度。結(jié)果顯示從6月齡開(kāi)始，EPAC2下調(diào)后Tau蛋白磷酸化水平增加，pT205、pT231、pS396、pS404位點(diǎn)的磷酸化程度也增加。隨后我們把6月齡 EPAC2+/+和EPAC2-/-小鼠腦組織樣品分為可溶組分和不可溶組分，發(fā)現(xiàn)EPAC2-/-小鼠的Tau蛋白在不可溶組分中明顯增加。Bielschowsky銀染顯示，EPAC2-/-小鼠腦內(nèi)9月齡時(shí)即出現(xiàn)明顯Tau過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)

7、。
　　2、EPAC2下調(diào)通過(guò)激活CDK5影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。
　　Tau蛋白磷酸化是相關(guān)激酶酯酶調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果，為了找出在EPAC2下調(diào)體系中影響Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵因子，我們對(duì)相關(guān)激酶酯酶進(jìn)行了篩查，最后發(fā)現(xiàn)CDK5在EPAC2下調(diào)后活性成分表達(dá)明顯增加，下調(diào)CDK5可逆轉(zhuǎn)EPAC2下調(diào)引起的Tau蛋白過(guò)度磷酸化。
　　3、EPAC2下調(diào)通過(guò)激活Calpain活化CDK5。
　　Calpain是調(diào)節(jié)C

8、DK5活性主要因子，檢測(cè)顯示EPAC2-/-小鼠Calpain活性明顯高于EPAC2+/+小鼠。在EPAC2-/-小鼠體內(nèi)下調(diào)Calpain后CDK5活性降低，Tau磷酸化病變得到逆轉(zhuǎn)。
　　4、EPAC2下調(diào)激活TGF-β1/Calpain/CDK5通路影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。
　　經(jīng)驗(yàn)證，EPAC2對(duì)Calpain、CDK5的激活不是通過(guò)傳統(tǒng)的Ca2+活化造成的，為了找到EPAC2對(duì)CDK5的調(diào)節(jié)作用，我們篩選出TGF

9、-β1這個(gè)炎癥因子，進(jìn)一步通過(guò)TGF-β1/Calpain/CDK5通路進(jìn)行研究。
　　結(jié)論：
　　1、EPAC2下調(diào)導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化，不可溶Tau蛋白增加、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成等Tau病變。
　　2、EPAC2下調(diào)通過(guò)激活CDK5影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。
　　3、EPAC2下調(diào)通過(guò)激活Calpain活化CDK5。
　　4、EPAC2下調(diào)激活TGF-β1/Calpain/CDK5通路影響Tau蛋白磷酸