MLCK的PKA磷酸化位點在IL-8誘導的VSMCs增殖和遷移中的作用.pdf

1、根據(jù)世界衛(wèi)生組織2015年的實況報道，每年死于心血管疾病的人數(shù)多于其他任何死因。我國是心血管疾病高發(fā)國家，心血管疾病占我國每年總死亡病因的51％，因此，對心血管疾病的研究刻不容緩。心血管疾病通常都與動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生密切相關，而動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與一些炎性因子的介入密不可分。
　　白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)，是一種趨化性細胞因子，能夠促進炎癥細胞趨化，此外I

2、L-8有促進有絲分裂的作用，能夠直接引起細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)IL-8能夠促進血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和遷移，在AS的形成過程中發(fā)揮著重要作用。鑒于IL-8介導平滑肌細胞增殖和遷移的分子機制尚未完全闡明，因此有必要對此進行深入的研究。
　　肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是一種與細胞收縮相關的關鍵酶。作為一種多功能域蛋白

3、質(zhì)，MLCK能夠激活其下游的肌球蛋白輕鏈(Myosin light Chain，MLC)，引起細胞收縮。同時MLCK也可被多種其他激酶如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、Rho等磷酸化，從而調(diào)節(jié)其活性最終影響細胞功能。上述MLCK分子的激酶結合位點對MLCK功能的發(fā)揮具有不同的調(diào)節(jié)作用。近年來不斷有研究報道MLCK與動脈粥樣硬化的形成具有密切聯(lián)系，但MLCK分

4、子哪些激酶結合位點在平滑肌細胞增殖和遷移過程中發(fā)揮作用還未見報道。
　　目的:通過在豚鼠腦基底動脈平滑肌細胞(GbaSM-4)中過表達MLCK，探索MLCK在平滑肌細胞增殖和遷移中的作用，并構建MLCK的PKA位點模擬磷酸化和去磷酸化突變的真核表達載體，通過基因轉(zhuǎn)導技術探索MLCK的PKA磷酸化位點在IL-8誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移中的作用及相關信號通路調(diào)控機制。
　　方法:(1)細胞系:本實驗所用細胞為豚鼠腦基底動脈

5、平滑肌細胞GbaSM-4及MLCK表達敲低的MLCK-/Gba細胞;(2)表達載體:本實驗所用到的表達載體包括MLCK真核表達載體pCDNA3.1+-Flag-MLCK(簡稱pCDNA3.1+-MLCK)、MLCK的PKA位點模擬磷酸化突變體pCDNA3.1+-Flag-MLCK-S993D(簡稱MLCK-S993D)， MLCK的 PKA位點模擬去磷酸化突變體pCDNA3.1+-Flag-MLCK-S993A(簡稱MLCK-S993A

6、);(3)通過基因轉(zhuǎn)導技術將pCDNA3.1+-MLCK轉(zhuǎn)入GbaSM-4細胞中，使其過表達MLCK，研究MLCK對GbaSM-4細胞增殖、遷移能力的影響;同樣的方法將MLCK-S993D、MLCK-S993A轉(zhuǎn)入MLCK-/Gba細胞中，使其分別表達PKA位點模擬磷酸化和去磷酸化突變的MLCK分子，研究PKA位點不同磷酸化狀態(tài)對MLCK分子功能的影響;(4)用CCK-8的方法檢測細胞增殖情況;(5)用Boyden Chamber法檢測

7、細胞的遷移情況;(6)利用RT-PCR方法檢測與細胞增殖、遷移相關的細胞因子表達情況，如:PCNA、CyclinD1、α-SMA;(7)用Western blot方法檢測MLCK、α-SMA、p-ERK等蛋白的表達情況;(8)用明膠酶譜方法檢測細胞培養(yǎng)液中MMP2的活性;(9)實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:(1)20ng/mL IL-8刺激GbaSM-4細胞24h后，能

8、夠促進細胞的增殖和遷移能力，過表達MLCK分子也能夠增強GbaSM-4細胞增殖、遷移能力;(2)采用定點突變的方法，成功構建了MLCK分子PKA位點去磷酸化突變的真核表達載體MLCK-S993A，pCDNA3.1+-MLCK、MLCK-S993D由實驗室前期構建;(3)在20ng/mL IL-8誘導作用下，MLCK的PKA位點磷酸化與去磷酸化突變均不影響GbaSM-4細胞增殖作用;(4)在20ng/mL IL-8誘導作用下，MLCK分子

9、的PKA位點模擬磷酸化能夠促進GbaSM-4細胞遷移作用，模擬去磷酸化能抑制GbaSM-4細胞遷移作用;(5)當MLCK分子的PKA位點去磷酸化突變后，GbaSM-4細胞的p-ERK表達量降低。
　　結論:1.IL-8能夠促進GbaSM-4細胞的增殖和遷移作用，這種促進作用可能與上調(diào)MLCK的表達量相關。
　　2.MLCK的PKA磷酸化位點與IL-8誘導的GbaSM-4細胞增殖關系不明顯。
　　3.MLCK的PKA磷酸