若干補腎益氣中藥組分對哮喘小鼠氣道炎癥及嗜酸性粒細胞浸潤的影響.pdf

1、第一部分：若干補腎益氣中藥組分對哮喘小鼠氣道炎癥的影響
　　目的：根據(jù)激發(fā)的次數(shù)和時間的長短，建立急性和慢性哮喘小鼠模型，從動物行為學、小鼠氣道反應性、肺組織病理學、血清中OVA-IgE水平及相關炎性細胞因子等多方面，分析比較兩種哮喘模型氣道炎癥的特點，并觀察補腎益氣中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷及兩者組成的復方對急性與慢性哮喘小鼠氣道炎癥的影響。方法：(1)192只雌性Ba1b/c小鼠隨機分為24組，每組8只，分別為：急性哮喘組(1

2、2組)：急性正常對照組(A1組)、急性哮喘模型組(B1組)、地塞米松1mg/kg組(C1組)、淫羊藿苷低、中、高劑量組(D1-F1組)、黃芪甲苷低、中、高劑量組(G1-I1組)、淫羊藿苷+黃芪甲苷低、中、高劑量組(J1-L1組)；慢性哮喘組(12組)：慢性正常對照組(A2組)、慢性哮喘模型組(B2組)、地塞米松1mg/kg組(C2組)、淫羊藿苷低、中、高劑量組(D2-F2組)、黃芪甲苷低、中、高劑量組(G2-12組)、淫羊藿苷+黃芪甲苷

3、低、中、高劑量組(J2-L2組)；(2)模型建立及給藥：采用OVA致敏和激發(fā)建立哮喘小鼠模型，用OVA激發(fā)2周共7次建立急性哮喘小鼠模型；用OVA激發(fā)6周共21次建立慢性哮喘小鼠模型，每次激發(fā)前1小時腹腔注射給藥；(3)取材：最后一次激發(fā)6-12小時，用WBP全身體積描計儀檢測小鼠的Penh值；最后一次激發(fā)24小時后，麻醉后心臟取血，取肺泡灌洗液及肺組織；(4)觀察動物行為學改變；用Penh的增長百分比(Penh％)來反映小鼠氣道反應性

4、；進行肺病理HE染色及肺組織炎癥病理評分：用ELISA檢測小鼠血清中OVA-IgE的水平；用Luminex200檢測小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α等5種炎性細胞因子的水平。
　　結(jié)果：(1)急性與慢性哮喘小鼠氣道炎癥特點的比較：
　?、偻φ战M相比，卵蛋白(OVA)所誘導的急性哮喘模型組小鼠可出現(xiàn)頭面部瘙癢，呼吸加深，呼吸頻率加快，弓背，前肢縮抬，安靜少動等哮喘急性發(fā)作表現(xiàn)，而慢性哮喘模

5、型組小鼠激發(fā)后癥狀更加明顯，部分可伴有口唇、爪等不同程度的紫紺，同時伴有體重增長曲線緩慢。
　　②正常對照組小鼠多在霧化吸入Mch25-50mg/ml時，出現(xiàn)呼吸頻率加快，腹式呼吸，小鼠流涎，伴口唇、爪紫紺等呼吸困難癥狀。與相應正常對照組相比，哮喘模型組小鼠可較早出現(xiàn)呼吸困難的癥狀；急性與慢性哮喘模型組小鼠氣道反應性(Penh％)均較相應正常組升高，且急性哮喘模型組小鼠升高更加明顯。
　?、蹚姆尾±韺W觀察，急性哮喘模型組小鼠

6、肺組織氣道黏膜可見水腫，支氣管管腔縮小，部分可見黏液栓子，氣道周圍血管壁水腫充血，氣道黏膜層、黏膜下層及血管周圍有大量的炎性細胞浸潤，主要以嗜酸粒細胞、單核細胞及淋巴細胞浸潤為主，而慢性哮喘模型組小鼠肺組織除上述變化外，部分可見黏膜基底層增厚，上皮細胞輕度變性，細胞排列輕度紊亂等病理改變。
　?、芘c相應正常對照組相比，急性與慢性哮喘模型組小鼠血清特異性OVA-IgE的水平均升高，且慢性哮喘模型組小鼠升高更為明顯。
　　⑤與相

7、應正常對照組相比，哮喘模型組小鼠血清中TNF-α的水平均升高；但與相應正常組比較，IFN-γ在急性哮喘模型組小鼠血清中濃度無明顯變化，而在慢性哮喘模型組中卻有升高的趨勢；IL-4在正常對照組及急性哮喘模型組中均無法檢測，而在部分慢性哮喘模型組小鼠血清中可以檢測出。
　　(2)補腎益氣中藥組分對急性哮喘小鼠氣道炎癥的影響：
　?、倥c急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D1-F1組)、黃芪甲苷組G1-I1組)及復方組(J1

8、-L1組)小鼠哮喘癥狀表現(xiàn)均較模型組減輕；補腎益氣中藥組分組(D1-L1組)小鼠肺組織在炎癥細胞浸潤、黏液分泌，血管壁水腫、血管周圍滲出等方面也有不同程度的減輕。
　　②與急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D1-F1組)小鼠出現(xiàn)呼吸困難的時間較晚，且淫羊藿苷組(D1-F1組)小鼠Penh％下降。
　?、叟c急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D1-F1組)、黃芪甲苷低、中劑量組(G1、H1組)及復方中、高劑量組(

9、K1-L1組)小鼠血清中OVA-IgE水平均下降。
　　④與急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D1-F1組)小鼠血清中TNF-α的水平有下降的趨勢，且淫羊藿苷中劑量組(E1組)IFN-γ的水平有下降的趨勢；黃芪甲苷組(G1-I1組)小鼠血清中TNF-α的水平有下降的趨勢，且黃芪甲苷高劑量組(I1組)IFN-γ的水平也有下降的趨勢；復方中劑量組(K1組)小鼠血清中IFN-γ的水平有下降的趨勢。同時，各急性組小鼠血清中IL-4

10、和IL-10均無法檢測出。
　　(3)補腎益氣中藥組分對慢性哮喘小鼠氣道炎癥的影響：
　　①與慢性哮喘模型組(B2組)比較，補腎益氣中藥組分可改善哮喘小鼠的癥狀；同時，慢性哮喘小鼠的肺組織炎癥損傷程度也減輕。
　?、谂c慢性哮喘模型組(B2組)比較，補腎益氣中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷及復方組(D2-L2組)小鼠出現(xiàn)呼吸困難的時間較晚，且黃芪甲苷組(G2-I2組)及復方組(J2-L2組)小鼠Penh％下降較明顯。
　

11、?、垡蜣杰战M(D2-F2組)小鼠血清中OVA-IgE水平均顯著下降(P>0.05，P<0.01)，黃芪甲苷低劑量組(G2組)小鼠血清中OVA-IgE水平明顯下降(P<0.05)，而黃芪甲苷中、高劑量組(H2組、12組)水平升高，但差異均無顯著意義(P>0.05)；復方組(J2-L2組)小鼠血清中OVA-IgE水平均下降，且復方中劑量組(K2組)降低最為明顯，差異有顯著意義(P<0.05)。
　?、芘c慢性哮喘模型組(B2組)比較，

12、淫羊藿苷組(D2-F2組)小鼠血清中IFN-γ和IL-6的濃度均有下降的趨勢，且淫羊藿苷組小鼠BALF中IFN-γ的濃度也有較明顯的下降趨勢；黃芪甲苷低、高劑量組(G2、I2組)小鼠血清TNF-α的濃度有下降的趨勢，黃芪甲苷中、高劑量組(H2組、I2組)小鼠血清中IFN-γ的濃度有下降的趨勢，黃芪甲苷中劑量組(H2組)小鼠血清中IL-6的濃度有下降的趨勢；復方組(J2-L2組)小鼠血清中IL-6和TNF-α的濃度均有下降的趨勢，且復方中

13、、高劑量組(K2組、L2組)小鼠血清中IFN-γ的濃度有下降的趨勢。同時，IL-10在所有慢性組小鼠血清中均未檢測出，而IL-4可在部分慢性哮喘小鼠血清中檢測出。
　　結(jié)論：
　　(1)從動物行為學、氣道反應性、肺組織病理學、血清中OVA-IgE水平、血清中炎性細胞因子水平等多方面，比較急性與慢性哮喘模型組小鼠，可發(fā)現(xiàn)延長OVA激發(fā)次數(shù)和時間所造成的慢性哮喘小鼠模型可能更符合哮喘的臨床表現(xiàn)和氣道慢性炎癥特點，更適合進一步探討

14、哮喘的發(fā)病機制。
　　(2)補腎益氣中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷及兩者的復方均可改善哮喘小鼠的癥狀，減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥損傷，降低哮喘小鼠的氣道反應性，使哮喘小鼠血清中OVA-IgE及相關炎性細胞因子的水平下降，從而減輕急性與慢性哮喘小鼠氣道炎癥與氣道反應性。
　　第二部分：若干補腎益氣中藥組分對哮喘小鼠嗜酸性粒細胞浸潤的影響
　　目的：觀察補腎益氣中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷及兩者的復方對急性與慢性哮喘小鼠氣道中嗜酸

15、性粒細胞浸潤的影響，并進一步觀察這一作用是否與其調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞趨化因子、趨化因子受體有關。
　　方法：(1)144只雌性Balb/c小鼠隨機分為24組，每組6只，分別為：急性哮喘組(12組)：急性正常對照組(A1組)、急性哮喘模型組(B1組)、地塞米松1mg/kg組(C1組)、淫羊藿苷低、中、高劑量組(D1-F1組)、黃芪甲苷低、中、高劑量組(G1-I1組)、淫羊藿苷+黃芪甲苷低、中、高劑量組(J1-L1組)；慢性哮喘組(12組

16、)：慢性正常對照組(A2組)、慢性哮喘模型組(B2組)、地塞米松1mg/kg組(C2組)、淫羊藿苷低、中、高劑量組(D2-F2組)、黃芪甲苷低、中、高劑量組(G2-I2組)、淫羊藿苷+黃芪甲苷低、中、高劑量組(J2-L2組)；(2)模型建立及給藥：采用OVA致敏和激發(fā)建立哮喘小鼠模型，用OVA激發(fā)2周共7次建立急性哮喘小鼠模型；用OVA激發(fā)6周共21次建立慢性哮喘小鼠模型，每次激發(fā)前1小時腹腔注射給藥；(3)取材：最后一次激發(fā)24小時后

17、，麻醉后心臟取血，取肺泡灌洗液及肺組織；(4)觀察淫羊藿苷、黃芪甲苷及復方對哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒細胞計數(shù)的影響；采用Luminex200檢測小鼠血清中eotaxin、MCP-3、RANTES、IL-3、IL-5和GM-CSF等6種趨化因子和細胞因子的水平；用realtime-PCR觀察補腎益氣中藥組分對哮喘小鼠肺組織中相關趨化因子受體CCR3、CCR5mRNA表達的影響；用免疫印跡觀察補腎益氣中藥組分對哮喘小鼠肺組織中趨化因子受體

18、CCR3、CCR5及NF-κBp65蛋白的影響。
　　結(jié)果：(1)補腎益氣中藥組分對急性哮喘小鼠嗜酸性粒細胞浸潤的影響：
　　①與急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D1-F1組)、黃芪甲苷組(G1-I1組)及復方組(J1-L1組)小鼠BALF中嗜酸性粒細胞的數(shù)量均減少。
　?、谂c急性哮喘模型組(B1組)相比，淫羊藿苷組(D1-F1組)小鼠血清中eotaxin水平均下降，且淫羊藿苷低、中劑量組(D1組、E1細水平

19、顯著下降(P<0.05，P<0.01)；黃芪甲苷中、高劑量組(H1組、I1組)小鼠血清中eotaxin的水平均下降，但無統(tǒng)計學意義，黃芪甲苷低劑量組(G1組)eotaxin的水平明顯升高(P<0.01)；復方組(J1-L1組)小鼠血清中eotaxin的水平均下降，但無統(tǒng)計學意義。
　　③與急性哮喘模型組(B1組)相比，淫羊藿苷中劑量組(E1組)小鼠血清中MCP-3的水平下降，而淫羊藿苷低、高劑量組(D1組、F1組)的水平升高，且淫

20、羊藿苷高劑量組顯著升高(P<0.01)：黃芪甲苷組(H1-J1組)小鼠血清中MCP-3的水平均升高，但無統(tǒng)計學意義；復方組(J1-L1組)小鼠血清中MCP-3的水平均升高，且復方高劑量組(L1組)水平顯著升高(P<0.01)。
　?、芘c急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D1-F1組)小鼠血清中IL-5、GM-CSF和RANTES的水平有下降的趨勢；黃芪甲苷低、中劑量組(G1-H1組)小鼠血清中GM-CSF、IL-5和RAN

21、TES的水平有下降的趨勢；復方中劑量組(K1組)小鼠血清中GM-CSF、IL-5和RANTES的水平有下降的趨勢；各組小鼠血清中IL-3均無法檢測出。
　?、菖c急性哮喘模型組(B1組)相比，淫羊藿苷低劑量組(D1組)小鼠肺組織中CCR3mRNA的表達顯著下降(P<0.01)；黃芪甲苷高劑量組(I1組)小鼠肺組織中CCR3mRNA的表達明顯下降(P<0.05)；復方低、高劑量組(J2組、L2組)小鼠肺組織中CCR3mRNA的表達下降

22、，但均無統(tǒng)計學意義。與急性哮喘模型組(B1組)相比，淫羊藿苷組(D1-F1組)、黃芪甲苷組(G1-I1組)和復方組(J1-L1組)小鼠肺組織中CCR5mRNA的表達均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。
　?、夼c急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D1-F1組)能抑制哮喘小鼠肺組織中CCR3蛋白的表達，其中，淫羊藿苷低、中劑量組(D1-E1組)抑制作用較為明顯；黃芪甲苷組(G1-I1組)能抑制哮喘小鼠肺組織中CCR3蛋白

23、的表達，其中，黃芪甲苷低、高劑量組(G1組、I1組)作用較明顯；復方組(J1-L1組)小鼠肺組織中CCR3蛋白的表達均降低。與急性哮喘模型組(B1組)比較，補腎益氣中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷及兩者復方均能抑制急性哮喘小鼠肺組織中CCR5蛋白的表達。
　?、吲c急性哮喘模型組(B1組)比較，淫羊藿苷組(D卜Fl組)、黃芪甲苷組(G1-I1組)及復方組(J1-L1組)均未能明顯抑制哮喘小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達。
　　

24、(2)補腎益氣中藥組分對慢性哮喘小鼠嗜酸性粒細胞浸潤的影響：
　?、倥c慢性哮喘模型組(B2組)比較，淫羊藿苷組(D2-F2組)、黃芪甲苷組(G2-I2組)及復方組(J2-L2組)小鼠BALF中嗜酸性粒細胞的數(shù)量均減少。
　?、谂c慢性哮喘模型組(B2組)相比，淫羊藿苷低、高劑量組(D2組、F2組)小鼠血清中GM-CSF的水平下降，且淫羊藿苷高劑量組(F2組)顯著下降(P<0.05)；黃芪甲苷中、高劑量組(H2組、I2組)小鼠血

25、清中GM-CSF的水平顯著下降(P<0.05)；復方組(J2-L2組)小鼠血清中GM-CSF的水平下降，且復方低劑量組(J2組)中GM-CSF水平最低，但均無統(tǒng)計學意義。
　　③與慢性哮喘模型組(B2組)相比，淫羊藿苷組(D2-F2組)小鼠血清中eotaxin的水平均下降，且淫羊藿苷中劑量組(E2組)的水平明顯下降(P<0.05)；黃芪甲苷組(G2-I2組)小鼠血清中eotaxin的水平下降，但無統(tǒng)計學意義；復方組(J2-L2組)

26、小鼠血清中eotaxin的水平均下降，且復方低劑量組(J2組)中eotaxin水平最低，但均無統(tǒng)計學意義。
　?、芘c慢性哮喘模型組(B2組)相比，淫羊藿苷組(D2-F2組)小鼠血清中MCP-3的水平下降，且淫羊藿苷高劑量組(F2組)小鼠的MCP-3的水平下降最明顯，但無統(tǒng)計學意義；黃芪甲苷低、高劑量組(G2組、I2組)小鼠血清中MCP-3的水平下降，黃芪甲苷中劑量組(H2組)MCP-3的水平升高，但均無統(tǒng)計學意義：復方組(J2-L

27、2組)小鼠血清中MCP-3的水平均升高，且復方高劑量組(L2組)最高，但均無統(tǒng)計學意義。
　　⑤與慢性哮喘模型組(B2組)比較，淫羊藿苷組(D2-F2組)小鼠血清中IL-5的濃度有下降的趨勢；黃芪甲苷中、高劑量組(H2組、I2組)小鼠血清中IL-5的濃度有下降的趨勢；復方組(J2-L2組)小鼠血清中IL-5的濃度有下降的趨勢。IL-3在所有小鼠血清中均未檢測出。
　?、夼c慢性哮喘模型組(B2組)相比，淫羊藿苷中、高劑量組(E

28、2-F2組)小鼠BALF中eotaxin的濃度有較明顯的下降趨勢。IL-3、IL-5、GM-CSF、MCP-3和RANTES均無法在小鼠BALF中檢測出。
　?、吲c慢性哮喘模型組(B2組)比較，淫羊藿苷低、中劑量組(D2組、E2組)小鼠肺組織中CCR3mRNA的表達顯著下降(P<0.05，P<0.01)；黃芪甲苷高劑量組(I2組)小鼠肺組織中CCR3mRNA的表達明顯下降(P<0.05)；復方組(J2-L2組)小鼠肺組織中CCR3

29、mRNA的表達均下降，但無統(tǒng)計學意義。與慢性哮喘模型組(B2組)相比，淫羊藿苷組(D2-F2組)小鼠肺組織中CCR5mRNA的表達無明顯變化；黃芪甲苷中、高劑量組(H2組、I2組)小鼠肺組織中CCR5mRNA的表達下降，但無統(tǒng)計學意義；復方中、高劑量組(K2組，L2組)小鼠肺組織中CCR5mRNA的表達下降，但也無統(tǒng)計學意義。
　　⑧與慢性哮喘模型組(B2組)比較，補腎益氣中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷及兩者復方均能抑制慢性哮喘小鼠肺

30、組織中CCR3蛋白的表達。與慢性哮喘模型組(B2組)比較，淫羊藿苷和復方組(D2-F2組，J2-L2組)均不能明顯改變慢性哮喘小鼠肺組織中CCR5蛋白的表達；而黃芪甲苷高劑量組(I2組)能較明顯抑制慢性哮喘小鼠肺組織中CCR5蛋白的表達。
　　⑨與慢性哮喘模型組(B2組)比較，淫羊藿苷組(D2-F2組)肺組織中NF-κBp65蛋白的表達下降，其中，淫羊藿苷中劑量組(E2組)小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達最低；黃芪甲苷組(G

31、2-I2組)肺組織中NF-κBp65蛋白的表達下降，其中，黃芪甲苷高劑量組(I2組)肺組織中NF-κBp65蛋白的表達最低；復方組(J2-L2組)肺組織中NF-κBp65蛋白的表達也下降，其中，復方低劑量組(J2組)肺組織中NF-κBp65蛋白的表達最低。
　　結(jié)論：
　　(1)補腎益氣中藥組分淫羊藿苷、黃芪甲苷均可抑制急性與慢性哮喘小鼠氣道中嗜酸性粒細胞的浸潤，從而減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道反應性，此作用與其降低嗜酸性粒

32、細胞趨化因子的水平及相關趨化因子受體的表達有關。
　　(2)與益氣中藥組分黃芪甲苷比較，補腎中藥組分淫羊藿苷可更明顯降低急性與慢性哮喘小鼠血清中趨化因子eotaxin的水平，抑制小鼠肺組織中趨化因子受體CCR3的表達，從而減少哮喘小鼠氣道中嗜酸性粒細胞的浸潤。
　　(3)應用補腎中藥組分淫羊藿苷后，可明顯降低哮喘小鼠血清中趨化因子eotaxin的水平，抑制哮喘小鼠肺組織中趨化因子受體CCR3的表達，其作用與地塞米松類似，甚至