ETV1轉(zhuǎn)錄因子在胃腸間質(zhì)瘤中的實(shí)驗研究.pdf

1、背景和目的：
　　 胃腸間質(zhì)瘤(GIST)是胃腸道最常見的間葉組織腫瘤，主要由KIT或PDGFRA(KIT或PDGFRA是酪氨酸激酶受體)基因突變，導(dǎo)致酪氨酸激酶持續(xù)的活化引起細(xì)胞增殖分化失控導(dǎo)致GIST。目前，臨床針對突變KIT或PDGFRA基因為干擾靶點(diǎn)研發(fā)的藥物，比如伊馬替尼等抗腫瘤藥物，由于突變的KIT或PDGFRA基因存在多位點(diǎn)和二次突變的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致抗腫瘤藥物的耐藥，這需要我們進(jìn)一步尋找針對GIST的新干預(yù)靶點(diǎn)，從

2、而提高GIST的治療和預(yù)后。ETV1是轉(zhuǎn)錄因子ETS家族的成員之一，高表達(dá)于GIST，在GIST的基因轉(zhuǎn)錄過程中，ETV1是一個很主要的調(diào)節(jié)因子。本研究體外構(gòu)建干擾ETV1基因shRNA的載體，干擾ETV1表達(dá)，觀察其對GIST的生長和侵襲力的影響，以尋找新的GIST治療靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 (1)GIST-T1細(xì)胞的培養(yǎng)：GIST-T1細(xì)胞(由上海拜力生物公司提供)，并采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)

3、。
　　 (2)體外構(gòu)建干擾hETV1基因shRNA的慢病毒載體，繼而感染GIST-T1細(xì)胞。試驗分組分成三組：空白組，陰性對照組(PLVX-shRNA組)，實(shí)驗組(PLVX-shRNA-hETV1組)，分別進(jìn)行下述實(shí)驗，最后比較組間的差異性。
　　 (3)慢病毒轉(zhuǎn)染GIST-T1細(xì)胞前后各項指標(biāo)檢測：①hETV1蛋白表達(dá)強(qiáng)度的測定：采用WesternBlot方法；②觀察細(xì)胞生長的變化：采用MTT法；③細(xì)胞凋亡的觀察：采

4、用流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染色法；④體外侵襲力的檢測：采用Transwell法測定；⑤C-KIT及MMP-2蛋白表達(dá)的強(qiáng)度測定：采用細(xì)胞免疫化學(xué)方法。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)比較體外干擾hETV1轉(zhuǎn)錄因子的各個靶點(diǎn)基因?qū)D(zhuǎn)染后GIST-T1細(xì)胞hETV1蛋白表達(dá)強(qiáng)度的檢測。
　　 通過體外構(gòu)建hETV1-shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染GIST-T1細(xì)胞，用WesternBlot方法檢測三大

5、組hETV1蛋白的表達(dá)，實(shí)驗組中PLVX-shRNA-hETV1-3亞組hETV1蛋白基本不表達(dá)，而空白組明顯表達(dá)，陰性對照組和實(shí)驗組中的各亞組(包括PLVX-shRNA-hETV1-1、PLVX-shRNA-hETV1-2、PLVX-shRNA-hETV1-4)hETV1蛋白基本表達(dá)相一致，通過分析其灰度值，分別與PLVX-shRNA-hETV1-3亞組比較，其hETV1蛋白表達(dá)量較高(圖3.3和圖3.4)，有顯著差異(P<0.05)

6、，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (2)體外干擾hETV1轉(zhuǎn)錄因子對GIST-T1細(xì)胞生長和凋亡的影響。
　　 通過篩選，選擇干擾效果最好的hETV1-shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染GIST-T1細(xì)胞，通過采用MTT。法檢測轉(zhuǎn)染后第1、4、7、10、13天的OD值，最后分別描述成生長曲線，實(shí)驗組較空白組和陰性對照組的生長曲線在第1至6天之間無明顯下降趨勢，而第6天之后，出現(xiàn)了一個明顯下移趨勢(表3.1和圖3.7)，總之，空白組、陰性對

7、照組和實(shí)驗組，在第1至6天之間無差異(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義，而第6天之后有明顯差異(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；另外通過流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗組與空白組及陰性對照組相比較，實(shí)驗組的細(xì)胞早、晚期凋亡率明顯高于空白組和陰性對照組(圖3.8和表3.3)，有顯著差異(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義，但主要以晚期凋亡為主。
　　 (3)體外干擾hETV1轉(zhuǎn)錄因子對GIST-T1細(xì)胞侵襲力和蛋白表達(dá)的影響。
　　

8、選擇干擾效果最好的hETV1-shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染GIST-T1細(xì)胞，采用Transwell法觀察發(fā)現(xiàn)，空白組穿過濾過膜的平均細(xì)胞數(shù)為166.2/HP，陰性對照組穿過濾膜的平均細(xì)胞數(shù)為142.2/HP，實(shí)驗組穿過濾膜的平均細(xì)胞數(shù)為60.2/HP。實(shí)驗組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于空白組及陰性對照組(圖3.9和表3.4)，有顯著差異(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；另外通過細(xì)胞免疫化學(xué)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗組C-KIT蛋白及MMP-2蛋白染色明顯比空

9、白組及陰性對照組較淺，同時通過平均光密度分析，也比空白組及陰性對照組密度低(圖4.0和表3.5)，有顯著差異(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 (1)通過體外干擾hETV1轉(zhuǎn)錄因子，可使GIST-T1細(xì)胞hETV1基因表達(dá)明顯下調(diào)，從而影響體內(nèi)hETV1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終導(dǎo)致hETV1基因體外蛋白的表達(dá)量下降。
　　 (2)通過體外干擾hETV1轉(zhuǎn)錄因子，對GIST-T1細(xì)胞的前期生長無明顯