HBV感染病人肝臟組織中IP-10的表達與HBx誘導(dǎo)其表達的分子機制研究.pdf

1、目的：γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IP-10，CXCL10）是ELR–的CXC趨化家族成員之一，也是CXCR3 受體的一個配體，可以趨化NK細胞，活化的T細胞，DC細胞等。在HBV感染的病人外周血單個核細胞，肝竇內(nèi)皮細胞，血小板中，IP-10的mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著增高。IP-10基因敲除的小鼠對穩(wěn)定性嗜神經(jīng)小鼠肝炎病毒的免疫反應(yīng)減弱，伴隨腦部CD4+和 CD8+淋巴細胞浸潤減少和炎性因子釋放減少。因此，在HBV感染中，IP-10的誘導(dǎo)表

2、達上調(diào)及其免疫效應(yīng)是一非常重要的事件。但是，誘導(dǎo)IP-10表達上調(diào)的分子機制及其意義還不是十分清楚。在此研究中首先檢測了不同病人肝組織中IP-10的表達，進一步通過細胞模型探索了HBx誘導(dǎo)趨化因子IP-10表達的分子機制及其白細胞趨化效應(yīng)。
　　 方法：
　　 1.在HBV感染病人肝臟組織中 IP-10表達的檢測12例（8例男性,4例女性；年齡在32-65之間，平均年齡48±9）接受外科手術(shù)治療的慢性HBV感染肝癌患者,

3、7例接受外科手術(shù)治療的非HBV感染肝癌患者和5例肝血管瘤患者肝臟正常組織分別從華中科技大學附屬同濟醫(yī)院和協(xié)和醫(yī)院收集，肝臟組織中IP-10 mRNA和蛋白的表達分別采用real-time PCR和免疫組織化學方法檢測。
　　 2.轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細胞IP-10表達的檢測轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2（pBlue-HBV，pCMV-HBs，pCMV-HBc，pCMV-HBx,）細胞培養(yǎng)上清中的IP-10采用ELISA方法檢測。<

4、br>　　 3.IP-10啟動子熒光素酶報告基因活性檢測一系列5'端截短突變的IP-10啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒和NF-κB突變的IP-10啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建，并與HBx真核表達質(zhì)粒pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染HepG2細胞。48h后檢測熒光素酶活性。
　　 4.凝膠遷徙阻滯實驗轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的細胞核抽提物與生物素標記的NF-κB1探針共同孵育，加入或不加入未標記的野生型NF-κB1探針或未標記的突變型N

5、F-κB1探針，隨后用6％聚丙烯酰胺凝膠在0.5×TBE中電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，Image Station 4000R成像檢測膜上化學發(fā)光信號。
　　 5.染色質(zhì)免疫共沉淀實驗
　　 HepG2細胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后用1％甲醛交聯(lián)，超聲打斷染色質(zhì)，與anti-p65抗體，anti-p50抗體或同型對照IgG一起孵育共沉淀。從染色體-抗體復(fù)合物中分離出DNA用于PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析。
　　 6.激光共聚焦顯微術(shù)轉(zhuǎn)

6、染不同質(zhì)粒的HepG2細胞爬片用冷甲醇固定，1％牛血清白蛋白封閉，anti-p65一抗孵育。FITC標記的二抗檢測信號，激光共聚焦顯微鏡觀察。
　　 7.趨化實驗趨化實驗采用5-μm孔徑的24孔Transwell板進行。1×105外周血單個核細胞用200 μl RPMI培養(yǎng)液懸浮加入到上室。1ml轉(zhuǎn)染了相應(yīng)質(zhì)粒的HepG2細胞上清液加入下室。Transwell板在37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后，對趨化的細胞HE染色，計數(shù)

7、。
　　 結(jié)果：
　　 1.HBV感染的肝臟組織中IP-10的表達采用real-time PCR和免疫組織化學方法檢測HBV感染肝臟組織中IP-10 mRNA和蛋白表達結(jié)果提示，HBV陽性的肝癌組織中IP-10的mRNA和蛋白表達均顯著高于HBV陰性肝癌組織以及肝血管瘤的正常肝臟組織，這些數(shù)據(jù)表明，在HBV感染的肝臟組織中IP-10的表達升高，可能在HBV誘導(dǎo)的肝臟炎癥損傷中起著重要作用。
　　 2.HepG2細

8、胞中HBx蛋白誘導(dǎo)IP-10的表達轉(zhuǎn)染了HBV全長表達質(zhì)粒（pBlue-HBV）后，HepG2細胞培養(yǎng)上清液中IP-10蛋白水平顯著增高。為了檢測HBV不同蛋白分子對誘導(dǎo)IP-10的作用，分別轉(zhuǎn)染了編碼不同HBV蛋白分子的真核表達質(zhì)粒（pCMV-HBs，pCMV-HBc，pCMV-HBx），結(jié)果表明HBx蛋白可以顯著增加IP-10的表達。IP-10啟動子熒光素酶活性分析結(jié)果提示IP-10的啟動子能被HBx蛋白呈劑量依賴性激活。
　

9、　 3.HBx誘導(dǎo)的IP-10表達上調(diào)是通過激活TRAF2/TAK1/NF-κB信號途徑為了探討HBx誘導(dǎo)IP-10表達的機制，構(gòu)建了一系列5'端缺失的IP-10啟動子熒光素酶報告基因載體，并與HBx真核表達質(zhì)粒pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染HepG2細胞。熒光素酶活性檢測結(jié)果提示在IP-10啟動子nt-190 to-96區(qū)域?qū)Bx激活I(lǐng)P-10啟動子起重要作用，進一步分析發(fā)現(xiàn)在這一區(qū)域有兩個NF-κB結(jié)合位點（NF-κB1和NF-κB2）

10、。NF-κB結(jié)合位點定點突變實驗證實，IP-10啟動子的NF-κB1結(jié)合位點對HBx誘導(dǎo)IP-10表達起作用。加入NF-κB的抑制劑SN50后，可抑制HBx誘導(dǎo)的IP-10表達。同時，NF-κB亞單位p65和p50的增加能夠促進IP-10的表達。為了探討激活的NF-κB是否直接與IP-10啟動子結(jié)合而實現(xiàn)對其調(diào)控，進一步進行了EMSA和CHIP實驗。用生物素標記的IP-10啟動子NF-κB1寡核苷酸探針檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了pCMV-H

11、Bx質(zhì)粒的細胞核抽提物中NF-κB蛋白與DNA的結(jié)合增強；轉(zhuǎn)染了pCMV-HBx質(zhì)粒的細胞核抽提物，用anti-p50或anti-p65抗體進行免疫沉淀，沉淀物分離出的DNA能夠擴增出177bp的IP-10啟動子序列。以上結(jié)果顯示，NF-κB能夠與IP-10啟動子上的NF-κB1結(jié)合位點直接結(jié)合。為了進一步探討HBx激活NF-κB的機制，western blot、啟動子熒光素酶活性以及共聚焦顯微鏡術(shù)檢測結(jié)果提示，在轉(zhuǎn)染了HBx蛋白真核表

12、達載體pCMV-HBx后，HepG2細胞中TAK1和IKKα的磷酸化水平增加。加入TAK1的抑制劑或轉(zhuǎn)染TAK1的siRNA阻斷TAK1的作用后，NF-κB和IP-10的啟動子活性均被抑制。TRAF家族成員TRAF2阻斷后也能阻礙NF-κB和IP-10的啟動子活性。同時，在TAK1和TRAF2阻斷后NF-κB亞單位p65的核轉(zhuǎn)位被抑制。上述結(jié)果顯示，HBx誘導(dǎo)的IP-10轉(zhuǎn)錄表達是通過激活TRAF2/TAK1/NF-κB信號通路而實現(xiàn)的

13、。由此我們推測，HBx可能通過TLR信號傳導(dǎo)，TAK1被激活，進而激活I(lǐng)KK，最終激活NF-κB。
　　 4.HBx誘導(dǎo)IP-10表達上調(diào)增加外周血單個核細胞的趨化性趨化實驗結(jié)果表明，相比轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染了HBx,NF-κB p50或NF-κBp65真核表達質(zhì)粒的HepG2細胞上清液對外周血單個核細胞的趨化活性增加。加入抗IP-10的中和抗體后能減弱其對外周血單個核細胞的趨化。加入了NF-κB的抑制劑SN50后，能減弱轉(zhuǎn)染HB

14、x的細胞上清誘導(dǎo)外周血單個核細胞的趨化性。
　　 結(jié)論：本課題研究證明HBV陽性的肝癌組織中IP-10的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于HBV陰性肝癌組織以及肝血管瘤的正常肝臟組織，提示在HBV感染的肝臟組織中IP-10的表達可能在HBV誘導(dǎo)的肝臟炎癥損傷中起著重要作用。在此基礎(chǔ)上進一步通過轉(zhuǎn)染了編碼HBV不同蛋白基因的HepG2細胞模型，探討了HBV誘導(dǎo)IP-10表達的機制，研究證明病毒蛋白HBx可誘導(dǎo)炎性趨化因子IP-10表