HBV感染巨噬細胞的可能途徑及HBx誘導Grp78與MHC-I類分子表達的研究.pdf

1、目的：研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(HBV)可以感染多種免疫細胞,巨噬細胞作為免疫細胞能否被HBV感染及其感染機制目前尚不清楚。微顆粒是具有雙層脂質結構的囊狀小體,多項研究表明其可作為細胞間傳遞信息和物質的載體。本研究從HBV陽性患者外周血中分離微顆粒與巨噬細胞混合培養(yǎng)后,檢測巨噬細胞HBV顆粒以及不同蛋白的表達,探討微顆粒介導HBV感染巨噬細胞的可能性，進一步探討HBV感染細胞后對Grp78及MHC-Ⅰ表達的調控作用。
　　方法：

2、>　　1.從HBV陽性患者的外周血中分離微顆粒作為實驗組,來自HBV陰性個體外周血的微顆粒作為對照組;
　　2.從兩組中采集一部分微顆粒做熒光染色(PKH-26標記微顆粒,FITC標記HBV),并使用激光共聚焦顯微鏡觀察微顆粒內是否包涵HBV,其余微顆粒與巨噬細胞(U937細胞)混合培養(yǎng)8h及24h;
　　3.采用PKH-26和CFSE分別對微顆粒和巨噬細胞染色;
　　4.采用激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞內微顆粒;

3、r>　　5.采用透射電鏡觀察巨噬細胞內HBV病毒顆粒;
　　6.采用細胞免疫組化方法檢測巨噬細胞內HBcAg表達;ELISA法檢測巨噬細胞內和上清內HBsAg和HBeAg的表達;采用細胞免疫熒光方法檢測巨噬細胞內HBcAg和HBx蛋白表達;
　　7.采用real-timePCR方法分別檢測巨噬細胞內HBV DNA和HBV-cccDNA水平,同時檢測巨噬細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA水平;
　　8.分離提取被HBV感染的巨

4、噬細胞釋放的微顆粒,與新的巨噬細胞混合培養(yǎng)后采用real-timePCR方法檢測細胞內HBV DNA水平。
　　9.傳染HBx質粒至HepG2細胞,采用流式細胞術研究HepG2細胞表面MHC-Ⅰ、Grp78和MICA/B分子的表達情況;
　　10.采用雙光子共聚焦顯微鏡觀察細胞表面MHC-Ⅰ分子和Grp78分子的定位情況;
　　11.通過siGrp78和HBx質粒共轉染以及siHLA和HBx質粒共轉染至HepG2細胞,

5、采用流式細胞術研究HepG2細胞表面MHC-Ⅰ及Grp78分子的表達;
　　12.轉染HBx質粒至T2細胞和H22細胞,采用流式細胞術研究兩種細胞表面MHC-Ⅰ、Grp78分子的表達;
　　13.將NK細胞與轉染HBx質粒的H22細胞共同培養(yǎng),采用流式細胞術觀察NK細胞對后者的殺傷效應。
　　結果：
　　1.共聚焦顯微鏡觀察可見來自HBV陽性患者外周血的微顆粒內包涵有HBV?；旌吓囵B(yǎng)8h后,可在巨噬細胞內發(fā)現(xiàn)微顆

6、粒。
　　2.混合培養(yǎng)24h后,可通過透射電鏡在HBV陽性組巨噬細胞內觀察到HBV病毒顆粒。
　　3.混合培養(yǎng)24h后,經免疫組化染色發(fā)現(xiàn)巨噬細胞內HBcAg染色呈陽性,細胞免疫熒光方法檢測到巨噬細胞內有HBcAg和HBx蛋白表達;而對照組未觀察到病毒顆粒以及HBcAg及HBx蛋白表達;
　　4.ELISA結果提示HBV陽性組巨噬細胞通過凍融和裂解兩種方法提取的抗原及培養(yǎng)上清內的HBsAg和HBeAg表達呈陽性,對照組

7、則呈陰性;
　　5.定量分析結果顯示,混合培養(yǎng)24h以后,實驗組巨噬細胞內HBV DNA、HBV-cccDNA水平和巨噬細胞培養(yǎng)上清液的HBV DNA水平均明顯高于對照組;
　　6.分離提取了三代被HBV感染的巨噬細胞釋放的微顆粒,與未感染的巨噬細胞混合培養(yǎng)后,結果提示,連續(xù)四代細胞內HBV DNA水平均呈陽性。
　　7.轉染HBx質粒后HepG2細胞MHC-Ⅰ和Grp78表達升高,MICA/B分子表達則無明顯變化;<

8、br>　　8.雙光子共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)HepG2細胞表面MHC-Ⅰ分子和Grp78分子表現(xiàn)為共定位情況,提示二者以復合體形式存在于細胞表面;
　　9.SiGrp78和HBx質粒共轉染以及siHLA和HBx質粒共轉染至HepG2細胞后發(fā)現(xiàn)MHC-Ⅰ與Grp78分子的表達具有相關性。
　　10.NK細胞對于轉染HBx質粒的H22細胞殺傷效率下降。
　　結論：HBV陽性患者外周血的微顆粒包涵有HBV,并可介導感染巨噬細胞,提示