LNX2通過Numb-Notch信號通路調(diào)控破骨細(xì)胞的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　在人體內(nèi)骨的內(nèi)穩(wěn)態(tài)是由骨重建維持的，骨重建包括陳舊的或者受損的骨由破骨細(xì)胞清除和成骨細(xì)胞生成新骨代替兩部分。當(dāng)骨重建失去平衡時會導(dǎo)致骨量減少，如骨質(zhì)疏松，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，Paget病等;或者骨量紊亂增加，形成骨硬化癥等。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)是由全身激素，在骨顯微環(huán)境中相鄰細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和生長因子等共同完成的。
　　Notch信號通路廣泛表達(dá)于胚胎和成熟個體組織，是高度保守的信號通路，對于調(diào)控胚胎發(fā)育

2、、成熟組織器官穩(wěn)態(tài)及免疫細(xì)胞發(fā)揮功能等方面具有重要作用。Notch信號通路包括Notch配體、受體以及下游信號傳導(dǎo)分子及調(diào)節(jié)分子。Notch受體蛋白經(jīng)過furin-like蛋白酶，整合素金屬蛋白酶(ADAM)和γ-分泌酶多蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的三次酶切，釋放了具有活性的細(xì)胞內(nèi)區(qū)(NICD)。NICD隨后進(jìn)入細(xì)胞核，激活CSL介導(dǎo)的Notch信號通路及下游的HES基因。
　　在人類和小鼠的基因方面的研究表明，Notch信號通路在骨的生長發(fā)

3、育及代謝中扮演著重要的角色。Notch信號通路在誘導(dǎo)分化的早期可以刺激間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨分化，但是在分化的后期Notch信號通路卻抑制了進(jìn)一步的分化，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化早期，Notch信號可以維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。Notch信號通路也可以通過多種方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化。Notch信號通路既可以直接抑制破骨細(xì)胞生成，也可以通過降低成骨細(xì)胞分泌M-CSF和RANKL等抑制破骨細(xì)胞生成。Notch信號通路對于骨重建的調(diào)節(jié)作用復(fù)

4、雜，具有時效性。
　　Numb是膜相關(guān)受體蛋白，是一種細(xì)胞命運決定因子，Numb可以招募E3泛素連接酶，介導(dǎo)NICD內(nèi)吞至溶酶體降解，拮抗Notch信號通路影響不同細(xì)胞的發(fā)育命運。
　　LNX蛋白（Ligand of Numb-proteinX）是第一種被描述的含有PDZ結(jié)構(gòu)的環(huán)指-E3泛素連接酶家族成員。LNX作為含有PDZ結(jié)構(gòu)的泛素連接酶，在泛素連接酶和協(xié)調(diào)信號通路等方面都發(fā)揮重要。LNX蛋白可以連接泛素和Numb，使其

5、發(fā)生蛋白酶依賴性的降解。
　　LNX和Numb在破骨細(xì)胞中的表達(dá)水平，以及他們是否調(diào)節(jié)Notch信號通路在破骨細(xì)胞中尚未有研究和報道，有待進(jìn)一步的研究。
　　實驗共分三大部分:
　　第一部分
　　目的:確定LNX在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá)水平的變化。
　　方法:采用Rankl體外誘導(dǎo)骨髓單核-巨噬細(xì)胞分化的方法生成破骨細(xì)胞，并檢測破骨細(xì)胞活性，用RT-PCR檢測LNX基因在誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞過程中表達(dá)水平

6、。
　　結(jié)果:用Rankl體外誘導(dǎo)骨髓單核-巨噬細(xì)胞分化的方法可以生成具有骨吸收能力的破骨細(xì)胞，隨著破骨細(xì)胞的分化，LNX1和LNX2基因水平均有上升，而LNX2表達(dá)水平明顯高于LNX1，有顯著性差異。
　　結(jié)論:LNX2可能對于破骨細(xì)胞分化有重要調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分
　　目的:觀察沉默LNX2對于破骨細(xì)胞分化和功能的影響;了解LNX2調(diào)控破骨細(xì)胞分化和功能的可能機制。
　　方法:構(gòu)建含LNX2 shR

7、NA的慢病毒，轉(zhuǎn)染骨髓單核-巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化，觀察沉默LNX2基因后對于破骨細(xì)胞分化和功能的影響。用WesternBlot，RT-PCR，免疫熒光等研究LNX2相關(guān)的Numb蛋白和Notch信號通路的改變。
　　結(jié)果:沉默LNX2后，破骨細(xì)胞的分化及功能被有效抑制，破骨細(xì)胞標(biāo)記物基因和蛋白水平降低;沉默LNX2會使得Numb蛋白水平上升，免疫熒光顯示Numb熒光表達(dá)量明顯升高，在細(xì)胞膜及細(xì)胞核周圍均有大量分布;降低了L

8、NX2的表達(dá)水平同時會降低了NICD1和NICD2的表達(dá)水平。免疫熒光顯示Notch2熒光表達(dá)量明顯降低，在細(xì)胞核周圍只有少量分布且Notch信號通路下游的Hes1基因表達(dá)水平有較大水平的降低。
　　結(jié)論:LNX2是破骨細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵性蛋白;LNX2可能通過Numb和Notch信號通路影響了破骨細(xì)胞的分化。
　　第三部分
　　目的:觀察過表達(dá)LNX2對于破骨細(xì)胞分化和功能的影響;了解LNX2調(diào)控破骨細(xì)胞分化和功能

9、的可能機制。
　　方法:構(gòu)建含人全長LNX2 DNA的逆病毒，轉(zhuǎn)染骨髓單核-巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化，觀察過表達(dá)LNX2基因后對于破骨細(xì)胞分化和功能的影響;用Western Blot，RT-PCR等研究Numb蛋白水平的改變。
　　結(jié)果:過表達(dá)人全長LNX2后，破骨細(xì)胞的分化受到部分抑制，但是受抑制程度遠(yuǎn)低于沉默LNX2時受抑制程度，破骨細(xì)胞標(biāo)記物和蛋白水平部分降低，Numb蛋白表達(dá)水平部分上升。
　　結(jié)論:過表達(dá)