生長(zhǎng)抑素對(duì)獼猴腸缺血再灌注后腸道菌群的影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的 多器官功能障礙(multiorgan dysfunction syndrome，MODS)是創(chuàng)傷及感染后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，在MODS的病理生理的研究中，腸源學(xué)說(shuō)和炎癥反應(yīng)失衡學(xué)說(shuō)是目前得到廣泛認(rèn)可的MODS的主要發(fā)病機(jī)制。腸缺血再灌注損傷后，腸道細(xì)菌及毒素移位是腸源學(xué)說(shuō)的主要機(jī)制。以往的研究多關(guān)注腸粘膜損傷及細(xì)菌移位的后果，但對(duì)于腸道菌群的變化以及細(xì)菌移位究竟發(fā)生于何處卻未涉及，而作為細(xì)菌移位的前提，研究腸道菌群的

2、變化情況及其原因，對(duì)于預(yù)防細(xì)菌移位及制定正確的臨床監(jiān)護(hù)措施意義重大。由于尚無(wú)有效的治療手段，MODS死亡率極高，至今仍是醫(yī)學(xué)面臨的重大難題。生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SST)是由神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道產(chǎn)生的一種廣泛分布于體內(nèi)的胃腸多肽，具有多種生理功能。已有研究報(bào)道SST抑制IIR時(shí)的氧化應(yīng)激，改善了MODS的組織學(xué)改變。但SST改善獼猴MODS所涉及的機(jī)制是否與小腸細(xì)菌量及菌群變化有關(guān)，尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究旨在了解腸缺血

3、再灌注后獼猴腸道菌群的變化及其對(duì)機(jī)體的影響，并從胃酸變化和腸道動(dòng)力變化的角度探討腸道菌群變化的原因；明確胃腸多肽與腸道細(xì)菌之間有無(wú)直接的相互作用；探討生長(zhǎng)抑素干預(yù)對(duì)腸缺血再灌注后腸道菌群的影響，以期闡明生長(zhǎng)抑素是否可通過(guò)改善腸道菌群紊亂而影響腸缺血再灌注損傷對(duì)機(jī)體的影響。 方法 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：全部實(shí)驗(yàn)所用健康成年獼猴來(lái)自成都野生動(dòng)物世界，雌雄不限，體重4～6Kg。獼猴進(jìn)出成都野生動(dòng)物世界獼猴喂養(yǎng)區(qū)時(shí)均檢疫合格。

4、2．實(shí)驗(yàn)分組：15只健康成年獼猴隨機(jī)分為對(duì)照組、腸缺血再灌注組和生長(zhǎng)抑素干預(yù)治療組。腸缺血再灌注組動(dòng)物行腸系膜上動(dòng)脈夾閉—松夾閉術(shù)；生長(zhǎng)抑素干預(yù)組在夾閉腸系膜上動(dòng)脈前，靜脈滴注生長(zhǎng)抑素5μg／kg／h。 3．各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察組織器官大體改變，獲取胃液、門靜脈血、外周血及回腸、結(jié)腸組織。 4．HE染色法觀察回腸及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。 5．用精密pH試紙測(cè)定胃液的pH值。 6．小腸及結(jié)腸灌洗液、粘膜組

5、織分別進(jìn)行需氧和厭氧細(xì)菌培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)分析小腸及結(jié)腸腔菌群及膜菌群。 7．采門靜脈血行血培養(yǎng)觀察有無(wú)菌血癥。 8．采用鱟試驗(yàn)法測(cè)定門靜脈血中內(nèi)毒素水平。 9．放射免疫測(cè)定法(RIA)檢測(cè)回腸全層組織勻漿、粘膜勻漿以及門靜脈和外周血中生長(zhǎng)抑素(SST)、血管活性腸肽(VIP)及P物質(zhì)(SP)含量。 10．免疫組化方法觀察SST、VIP、SP、Toll樣受體2及Toll樣受體4在小腸組織內(nèi)的分布。 1

6、1．獲得純培養(yǎng)的獼猴大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌分別與SST、VIP、SP在體外共同培養(yǎng)，觀察細(xì)菌與胃腸多肽之間的相互作用。 結(jié)果 1．正常獼猴小腸無(wú)菌率達(dá)40％，而腸缺血再灌注后所有動(dòng)物小腸細(xì)菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性，P<0.05。 2．獼猴IIR后，小腸及大腸腔內(nèi)細(xì)菌較正常分別增加約2×10<'6>倍和1×10<'2>倍，P<0.01。均以大腸桿菌等需氧菌為優(yōu)勢(shì)菌群。 3．獼猴IIR后回腸粘膜中Toll樣受體2及

7、Toll樣受體4表達(dá)明顯增強(qiáng)，以上皮細(xì)胞膜上的表達(dá)更為明顯。 4．獼猴IIR后，回腸粘膜出血壞死損傷明顯，結(jié)腸病變輕微。 5．對(duì)照組獼猴均無(wú)菌血癥，IIR組大腸桿菌菌血癥達(dá)100％，P<0.01。 6．IIR后，小腸明顯充血擴(kuò)張，胃內(nèi)pH值由2.8±0.84增至7.2±0.84，P<0.01。 7．免疫組化結(jié)果表明胃腸多肽(SST、VIP、SP)很少在粘膜下層表達(dá)，全腸壁組織中的胃腸多肽主要存在于肌層及粘

8、膜層。 8．全回腸組織中胃腸多肽(SST、VIP、SP)明顯增加，P<0.01；而粘膜中SST及VIP的濃度卻減少，P<0.01。 9．胃腸多肽與腸道細(xì)菌共同培養(yǎng)后，胃腸多肽的含量及細(xì)菌數(shù)量均無(wú)明顯變化。 10．以5μg／kg／h的劑量靜脈輸入SST后，外周血及門靜脈血中SST水平分別為29.3±5.97pg／ml和9.1±0.71pg/ml，較IIR(3.67±0.41pg/ml和4.49±0.33pg/ml)

9、時(shí)明顯升高，P<0.01。 11．SST干預(yù)后，小腸充血擴(kuò)張明顯改善；小腸粘膜內(nèi)SST恢復(fù)；小腸絨毛形態(tài)及粘液層完整，無(wú)粘膜下出血及片狀粘膜糜爛。 12．SST干預(yù)后小腸腔菌群和膜菌群中需氧菌總數(shù)較ⅡR時(shí)明顯下降，分別減少約10<'3>(p<0.01)和10<'2>倍(p<0.05)，其中均以大腸桿菌減少為主，厭氧菌/需氧菌比值均較ⅡR組顯著上升，基本達(dá)到正常水平，大腸桿菌厚L酸桿菌的比值也降至正常。 13．SS

10、T干預(yù)后，門靜脈血中的LPS水平(0.59±0.13EU/ml)較ⅡR組(1.48±0.32EU/ml)顯著下降，p<0.01；與正常組(0.33±0.03EU/ml)相比無(wú)差異，p>0.05。 14．SST干預(yù)后，胃內(nèi)未見(jiàn)膽汁反流，其pH值為5.4±0.55，與ⅡR(7.2±0.84)相比，顯著下降，p<0.05；但仍高于正常對(duì)照組2.8±0.84，p<0.05。 15．ⅡR時(shí)，與正常對(duì)照相比，回腸肌層中SST增加了1

11、31[％]，VIP增加了257.3[％]，p<0.01；SST干預(yù)后，回腸肌層SST和VIP較ⅡR分別減少了220[％]和249.2[％]，二者均已與正常時(shí)無(wú)明顯差別，P>0.05。 結(jié)論 1．盡管獼猴的食物衛(wèi)生狀況遠(yuǎn)不如人類，但正常獼猴小腸菌群與人類相似，提示獼猴決定小腸菌群的上消化道綜合殺菌機(jī)制可能較人類更為強(qiáng)大。 2．ⅡR后結(jié)腸細(xì)菌總量及大腸桿菌等需氧菌數(shù)量雖然也明顯增加，厭氧菌對(duì)結(jié)腸粘膜的保護(hù)功能可能有所

12、削弱，但獼猴結(jié)腸粘膜損傷并不明顯，也未出現(xiàn)腹瀉，表明ⅡR后大量繁殖的大腸桿菌的致病靶組織并不在結(jié)腸粘膜。 3．大腸桿菌通過(guò)回腸TLR4介導(dǎo)，導(dǎo)致小腸粘膜屏障的嚴(yán)重急性損傷，成為細(xì)菌移位的門戶。 4．ⅡR后，胃內(nèi)酸度降低，胃酸的殺菌功能喪失，是小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)的重要原因之一。 5．小腸動(dòng)力低下是ⅡR時(shí)，腸道菌群紊亂的重要啟動(dòng)因素；而菌群紊亂又加劇了小腸麻痹，二者形成惡性循環(huán)。 6．大腸桿菌、腸球菌及乳酸桿菌

13、并不能裂解胃腸多肽，而且胃腸多肽在體外與各種細(xì)菌共同孵育后也并未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制作用。 7．獼猴ⅡR后，小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)既可能由小腸動(dòng)力降低直接導(dǎo)致，也可能是小腸動(dòng)力降低-膽汁反流-胃內(nèi)pH值升高-上消化道殺菌屏障破壞等系列事件的后果。小腸肌間神經(jīng)叢中的SST及VIP增加可能是此刻小腸動(dòng)力降低的啟動(dòng)因素。 8．ⅡR后，循環(huán)中生長(zhǎng)抑素水平顯著下降，靜脈滴注生長(zhǎng)抑素5μg/kg/h即可有效恢復(fù)循環(huán)中生長(zhǎng)抑素濃度。