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1、研究背景及目的 多器官功能障礙(multiorgan dysfunction syndrome,MODS)是創(chuàng)傷及感染后最嚴(yán)重的并發(fā)癥,在MODS的病理生理的研究中,腸源學(xué)說(shuō)和炎癥反應(yīng)失衡學(xué)說(shuō)是目前得到廣泛認(rèn)可的MODS的主要發(fā)病機(jī)制。腸缺血再灌注損傷后,腸道細(xì)菌及毒素移位是腸源學(xué)說(shuō)的主要機(jī)制。以往的研究多關(guān)注腸粘膜損傷及細(xì)菌移位的后果,但對(duì)于腸道菌群的變化以及細(xì)菌移位究竟發(fā)生于何處卻未涉及,而作為細(xì)菌移位的前提,研究腸道菌群的
2、變化情況及其原因,對(duì)于預(yù)防細(xì)菌移位及制定正確的臨床監(jiān)護(hù)措施意義重大。由于尚無(wú)有效的治療手段,MODS死亡率極高,至今仍是醫(yī)學(xué)面臨的重大難題。生長(zhǎng)抑素(somatostatin,SST)是由神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道產(chǎn)生的一種廣泛分布于體內(nèi)的胃腸多肽,具有多種生理功能。已有研究報(bào)道SST抑制IIR時(shí)的氧化應(yīng)激,改善了MODS的組織學(xué)改變。但SST改善獼猴MODS所涉及的機(jī)制是否與小腸細(xì)菌量及菌群變化有關(guān),尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究旨在了解腸缺血
3、再灌注后獼猴腸道菌群的變化及其對(duì)機(jī)體的影響,并從胃酸變化和腸道動(dòng)力變化的角度探討腸道菌群變化的原因;明確胃腸多肽與腸道細(xì)菌之間有無(wú)直接的相互作用;探討生長(zhǎng)抑素干預(yù)對(duì)腸缺血再灌注后腸道菌群的影響,以期闡明生長(zhǎng)抑素是否可通過(guò)改善腸道菌群紊亂而影響腸缺血再灌注損傷對(duì)機(jī)體的影響。 方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:全部實(shí)驗(yàn)所用健康成年獼猴來(lái)自成都野生動(dòng)物世界,雌雄不限,體重4~6Kg。獼猴進(jìn)出成都野生動(dòng)物世界獼猴喂養(yǎng)區(qū)時(shí)均檢疫合格。
4、2.實(shí)驗(yàn)分組:15只健康成年獼猴隨機(jī)分為對(duì)照組、腸缺血再灌注組和生長(zhǎng)抑素干預(yù)治療組。腸缺血再灌注組動(dòng)物行腸系膜上動(dòng)脈夾閉—松夾閉術(shù);生長(zhǎng)抑素干預(yù)組在夾閉腸系膜上動(dòng)脈前,靜脈滴注生長(zhǎng)抑素5μg/kg/h。 3.各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,觀察組織器官大體改變,獲取胃液、門靜脈血、外周血及回腸、結(jié)腸組織。 4.HE染色法觀察回腸及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。 5.用精密pH試紙測(cè)定胃液的pH值。 6.小腸及結(jié)腸灌洗液、粘膜組
5、織分別進(jìn)行需氧和厭氧細(xì)菌培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)分析小腸及結(jié)腸腔菌群及膜菌群。 7.采門靜脈血行血培養(yǎng)觀察有無(wú)菌血癥。 8.采用鱟試驗(yàn)法測(cè)定門靜脈血中內(nèi)毒素水平。 9.放射免疫測(cè)定法(RIA)檢測(cè)回腸全層組織勻漿、粘膜勻漿以及門靜脈和外周血中生長(zhǎng)抑素(SST)、血管活性腸肽(VIP)及P物質(zhì)(SP)含量。 10.免疫組化方法觀察SST、VIP、SP、Toll樣受體2及Toll樣受體4在小腸組織內(nèi)的分布。 1
6、1.獲得純培養(yǎng)的獼猴大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌分別與SST、VIP、SP在體外共同培養(yǎng),觀察細(xì)菌與胃腸多肽之間的相互作用。 結(jié)果 1.正常獼猴小腸無(wú)菌率達(dá)40%,而腸缺血再灌注后所有動(dòng)物小腸細(xì)菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性,P<0.05。 2.獼猴IIR后,小腸及大腸腔內(nèi)細(xì)菌較正常分別增加約2×10<'6>倍和1×10<'2>倍,P<0.01。均以大腸桿菌等需氧菌為優(yōu)勢(shì)菌群。 3.獼猴IIR后回腸粘膜中Toll樣受體2及
7、Toll樣受體4表達(dá)明顯增強(qiáng),以上皮細(xì)胞膜上的表達(dá)更為明顯。 4.獼猴IIR后,回腸粘膜出血壞死損傷明顯,結(jié)腸病變輕微。 5.對(duì)照組獼猴均無(wú)菌血癥,IIR組大腸桿菌菌血癥達(dá)100%,P<0.01。 6.IIR后,小腸明顯充血擴(kuò)張,胃內(nèi)pH值由2.8±0.84增至7.2±0.84,P<0.01。 7.免疫組化結(jié)果表明胃腸多肽(SST、VIP、SP)很少在粘膜下層表達(dá),全腸壁組織中的胃腸多肽主要存在于肌層及粘
8、膜層。 8.全回腸組織中胃腸多肽(SST、VIP、SP)明顯增加,P<0.01;而粘膜中SST及VIP的濃度卻減少,P<0.01。 9.胃腸多肽與腸道細(xì)菌共同培養(yǎng)后,胃腸多肽的含量及細(xì)菌數(shù)量均無(wú)明顯變化。 10.以5μg/kg/h的劑量靜脈輸入SST后,外周血及門靜脈血中SST水平分別為29.3±5.97pg/ml和9.1±0.71pg/ml,較IIR(3.67±0.41pg/ml和4.49±0.33pg/ml)
9、時(shí)明顯升高,P<0.01。 11.SST干預(yù)后,小腸充血擴(kuò)張明顯改善;小腸粘膜內(nèi)SST恢復(fù);小腸絨毛形態(tài)及粘液層完整,無(wú)粘膜下出血及片狀粘膜糜爛。 12.SST干預(yù)后小腸腔菌群和膜菌群中需氧菌總數(shù)較ⅡR時(shí)明顯下降,分別減少約10<'3>(p<0.01)和10<'2>倍(p<0.05),其中均以大腸桿菌減少為主,厭氧菌/需氧菌比值均較ⅡR組顯著上升,基本達(dá)到正常水平,大腸桿菌厚L酸桿菌的比值也降至正常。 13.SS
10、T干預(yù)后,門靜脈血中的LPS水平(0.59±0.13EU/ml)較ⅡR組(1.48±0.32EU/ml)顯著下降,p<0.01;與正常組(0.33±0.03EU/ml)相比無(wú)差異,p>0.05。 14.SST干預(yù)后,胃內(nèi)未見(jiàn)膽汁反流,其pH值為5.4±0.55,與ⅡR(7.2±0.84)相比,顯著下降,p<0.05;但仍高于正常對(duì)照組2.8±0.84,p<0.05。 15.ⅡR時(shí),與正常對(duì)照相比,回腸肌層中SST增加了1
11、31[%],VIP增加了257.3[%],p<0.01;SST干預(yù)后,回腸肌層SST和VIP較ⅡR分別減少了220[%]和249.2[%],二者均已與正常時(shí)無(wú)明顯差別,P>0.05。 結(jié)論 1.盡管獼猴的食物衛(wèi)生狀況遠(yuǎn)不如人類,但正常獼猴小腸菌群與人類相似,提示獼猴決定小腸菌群的上消化道綜合殺菌機(jī)制可能較人類更為強(qiáng)大。 2.ⅡR后結(jié)腸細(xì)菌總量及大腸桿菌等需氧菌數(shù)量雖然也明顯增加,厭氧菌對(duì)結(jié)腸粘膜的保護(hù)功能可能有所
12、削弱,但獼猴結(jié)腸粘膜損傷并不明顯,也未出現(xiàn)腹瀉,表明ⅡR后大量繁殖的大腸桿菌的致病靶組織并不在結(jié)腸粘膜。 3.大腸桿菌通過(guò)回腸TLR4介導(dǎo),導(dǎo)致小腸粘膜屏障的嚴(yán)重急性損傷,成為細(xì)菌移位的門戶。 4.ⅡR后,胃內(nèi)酸度降低,胃酸的殺菌功能喪失,是小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)的重要原因之一。 5.小腸動(dòng)力低下是ⅡR時(shí),腸道菌群紊亂的重要啟動(dòng)因素;而菌群紊亂又加劇了小腸麻痹,二者形成惡性循環(huán)。 6.大腸桿菌、腸球菌及乳酸桿菌
13、并不能裂解胃腸多肽,而且胃腸多肽在體外與各種細(xì)菌共同孵育后也并未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制作用。 7.獼猴ⅡR后,小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)既可能由小腸動(dòng)力降低直接導(dǎo)致,也可能是小腸動(dòng)力降低-膽汁反流-胃內(nèi)pH值升高-上消化道殺菌屏障破壞等系列事件的后果。小腸肌間神經(jīng)叢中的SST及VIP增加可能是此刻小腸動(dòng)力降低的啟動(dòng)因素。 8.ⅡR后,循環(huán)中生長(zhǎng)抑素水平顯著下降,靜脈滴注生長(zhǎng)抑素5μg/kg/h即可有效恢復(fù)循環(huán)中生長(zhǎng)抑素濃度。
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