小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)，作為胞內(nèi)生命活動的主要執(zhí)行者，許多蛋白質(zhì)只有經(jīng)歷翻譯后的加工才能具有生物活性。蛋白質(zhì)的棕櫚?；堑鞍踪|(zhì)翻譯后修飾的重要方式之一。DHHC蛋白家族是最早在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)與棕櫚酰化修飾作用相關(guān)的一類蛋白，它們大多具有蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(protein acyltransferase，PAT)活性。2004年隨著Bredt DS研究小組完成人類和小鼠基因組23種DHHC蛋白基因的克隆與鑒定，人們對于這類蛋白功能的了解也逐漸深入。目前，

2、有關(guān)棕櫚?；鞍踪|(zhì)組學(xué)和棕櫚?；D(zhuǎn)移酶DHHC家族的遺傳學(xué)分析結(jié)果，暗示蛋白質(zhì)的棕櫚?；谏窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育和相關(guān)神經(jīng)疾病的病發(fā)過程中可能起到重要的調(diào)控作用。因此，闡明棕櫚酰化修飾作用在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及分子調(diào)控機(jī)制成為了近些年神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)屬于多潛能干細(xì)胞，具有自我更新能力，并且在胚胎發(fā)育及成年腦中均能分化產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞

3、。NSCs的分化成熟，可以大致分為如下3個階段:
　　1）NSCs自我更新;
　　2)NSCs被賦予具有分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞;
　　3）退出周期，處于有絲分裂靜止期，分化形成具有特殊形態(tài)和功能的神經(jīng)細(xì)胞。
　　其實(shí)，在NSCs分化過程中，這些細(xì)胞形態(tài)和功能的改變很大程度上是由細(xì)胞所處不同階段的特定基因表達(dá)模式所決定的。其中，主要包括多潛能因子Sox2、原神經(jīng)基因bHLH(basic Helix-Loop-Hel

4、ix，bHLH)家族和細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs)。NSCs自我更新能力及干性維持的內(nèi)部機(jī)制主要是通過多潛能因子的表達(dá)和分化命運(yùn)決定因子的沉默而實(shí)現(xiàn)的。NSCs分化命運(yùn)決定的內(nèi)部機(jī)制也是通過時間和空間上高度精確的調(diào)控機(jī)制完成的，即分化命運(yùn)決定因子的激活與表達(dá)以及多潛能因子的沉默。
　　目前，研究發(fā)現(xiàn)真核基因的表達(dá)在多個層次上受到精確的調(diào)控，而染色質(zhì)的修飾

5、是真核基因轉(zhuǎn)錄的第一調(diào)控靶點(diǎn)。其中，組蛋白的共價修飾對染色質(zhì)的動態(tài)結(jié)構(gòu)具有核心調(diào)節(jié)作用，它是表觀遺傳學(xué)重要的調(diào)節(jié)方式之一。在神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)決定過程中常常伴隨著組蛋白乙酰化修飾水平的改變。組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)P300在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富，它參與了神經(jīng)系統(tǒng)在形式和功能上的發(fā)生、可塑性和穩(wěn)態(tài)的建立。P300通過自身的HAT活性，乙?；M蛋白賴氨酸，染色質(zhì)發(fā)生重塑，使轉(zhuǎn)錄因子易于與DNA

6、結(jié)合，從而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。其中，組蛋白H3和H4就是其乙?；矁r修飾的底物之一。
　　本研究中，我們通過建立視黃酸(retinoic acid，RA)誘導(dǎo)的P19細(xì)胞定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的體外模型，利用棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑——小分子化合物2-bromopalmitate(2BROP)，探討棕櫚?；揎椩贜SCs發(fā)育中的作用及相關(guān)表觀遺傳分子機(jī)制。
　　第一部分棕櫚?；揎椣嚓P(guān)蛋白在神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)
　　為了揭示棕

7、櫚?；揎椬饔檬欠駞⑴cNSCs發(fā)育過程，于NSCs發(fā)育的各階段，包括P19細(xì)胞多潛能狀態(tài)、NSCs增殖和NSCs分化等三個階段，分別檢測23個棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶即DHHC家族成員的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在NSCs發(fā)育階段，共有20個DHHC家族成員的mRNA表達(dá)。其中，DHHC1、4、7、9、24于NSCs發(fā)育各階段的mRNA表達(dá)無明顯變化。DHHC5、13、14、16、17、20、21成員于NSCs增殖階段mRNA的表達(dá)量獲得增高，并且DHH

8、C5、17、21在NSCs分化階段也將持續(xù)性高表達(dá)。而DHHC2、6、8、11、15、18、19、23成員的mRNA僅于NSCs分化階段高表達(dá)。
　　接下來，我們利用?；?生物素交換法(Acyl-biotinyl exchange method，ABE)技術(shù)，檢測NSCs增殖與分化兩階段，蛋白棕櫚?；揎椝角闆r。結(jié)果顯示，多種蛋白在NSCs增殖與分化階段被棕櫚?；揎棧⒃诓煌腘SCs發(fā)育階段，呈現(xiàn)出一定的特異性，如NSCs增

9、殖階段，棕櫚?；鞍讞l帶分布于～10、25、45、50、70、170kDa;而NSCs分化階段，蛋白分布于～25、55、60、70、100、125、150、290kDa。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大多數(shù)DHHC家族成員不同程度的表達(dá)于NSCs發(fā)育各階段，并且在不同的NSCs發(fā)育階段，棕櫚?；揎椀牡鞍壮尸F(xiàn)出一定的特異性，暗示DHHC家族成員和它們所介導(dǎo)的棕櫚酰化修飾參與NSCs發(fā)育過程的調(diào)控，棕櫚?；揎椏赡芡ㄟ^特異性的影響NSCs發(fā)

10、育各階段中關(guān)鍵蛋白的生物活性，從而參與調(diào)控NSCs的命運(yùn)決定。
　　第二部分小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用
　　為了研究棕櫚酰化修飾對NSCs增殖的影響，我們首先利用MTT技術(shù)，檢測不同劑量的2BROP對于細(xì)胞代謝活力的影響。結(jié)果顯示，與對照組(0μM)相比，1-15μM加藥組中細(xì)胞活力表現(xiàn)出一定的增強(qiáng);尤其是10μM加藥組，但是統(tǒng)計學(xué)無明顯差異。然而，與對照組相比，25μM和50μM加藥組中，細(xì)胞活力減弱，M

11、TT值明顯降低，并具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。與此同時，倒置相差顯微鏡，觀察神經(jīng)球的結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化。結(jié)果顯示，隨著RA誘導(dǎo)的進(jìn)行，對照組中，細(xì)胞聚集體不斷增大，最終形成一個結(jié)構(gòu)致密、表面規(guī)整的細(xì)胞團(tuán)。10μM終濃度加藥組組中，細(xì)胞聚集體的發(fā)生和增長過程與對照組相比，未見異常。但是，25μM加藥組中，細(xì)胞聚集體的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞團(tuán)形態(tài)不規(guī)則、內(nèi)部有空隙。
　　接下來，我們利用TUNEL技術(shù)，在NSCs增殖階段，檢測小分子化學(xué)物

12、2BROP對于細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，2BROP處理48h后，與對照組相比，10μM加藥組中，細(xì)胞團(tuán)中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)沒有明顯差異;而25μM處理組中，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。隨后，我們利用Western Blot和免疫熒光染色技術(shù)，檢測了相關(guān)凋亡信號通路的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25μM處理組中線粒體相關(guān)凋亡通路明顯激活。與對照組相比，25μM處理組中抗凋亡Bcl-2的表達(dá)量減少，促凋亡的Bax和活化的Caspase3的表達(dá)量增多

13、;而10μM加藥組中Bcl-2、Bax與活化的Caspase3表達(dá)量沒有明顯變化
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示在一定的劑量范圍內(nèi)，小分子化合物2BROP對于NSCs增殖過程，并沒有產(chǎn)生明顯的影響;而高濃度2BROP將會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，引發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　第三部分小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用
　　為了探究蛋白棕櫚?；揎椩贜SCs分化階段中的相關(guān)作用及其分子機(jī)制，我們利用免疫熒光技術(shù)和Western Blot等技

14、術(shù)，檢測神經(jīng)分化標(biāo)記物MAP2的表達(dá)與分布情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，2BROP處理組中，MAP2陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，統(tǒng)計學(xué)具有顯著性差異;且神經(jīng)分化各階段，MAP2蛋白的表達(dá)均受到明顯抑制。
　　接下來，利用Western Blot和qRT-PCR技術(shù)，我們檢測了NSCs分化命運(yùn)決定相關(guān)因子的表達(dá)情況，如多潛能因子Oct4;NSCs標(biāo)記物Sox2、Nestin;神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記物β-tubulinⅢ和神經(jīng)分化決定因子Neuro

15、g1、NeuroD1。結(jié)果顯示，隨著NSCs命運(yùn)的獲得，對照組與2BROP處理組中，Oct4的表達(dá)迅速下降直至消失，無明顯差異。與對照組相比，2BROP組中神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記物β-tubulinⅢ、分化命運(yùn)決定因子Neurog1和NeuroD1的表達(dá)于神經(jīng)分化各階段均呈現(xiàn)出明顯地降低。與此相反，2BROP處理組中，NSCs標(biāo)記物Sox2與Nestin卻表現(xiàn)出一定的持續(xù)性高表達(dá)。同時，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組分化各階段的MTT值無明顯變

16、化相比，2BROP處理組中，隨著分化天數(shù)的延長，MTT值呈現(xiàn)出一定的增。這些結(jié)果提示我們，在神經(jīng)分化階段，2BROP可能通過增強(qiáng)NSCs的干細(xì)胞特性的維持，從而阻礙神經(jīng)分化的發(fā)生。
　　為了驗(yàn)證NSCs分化階段2BROP是否增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力，我們首先利用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)，檢測分化階段細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，在神經(jīng)分化的第四天，與對照組相比，2BROP處理組中，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，并且統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。然后，我們

17、利用膜標(biāo)記-FACS技術(shù)追蹤細(xì)胞增殖的變化。分化階段的細(xì)胞使用熒光染料標(biāo)記。細(xì)胞每增殖一次，熒光強(qiáng)度便會減弱一半。結(jié)果顯示，懸浮培養(yǎng)24h后，對照組中單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并沒有明顯的變化;而2BROP處理后，單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度發(fā)生不同程度的減弱。
　　為了進(jìn)一步分析2BROP在NSCs分化階段對于細(xì)胞增殖和周期的影響，利用FACS技術(shù)，分析分化階段細(xì)胞周期的分布。結(jié)果顯示，神經(jīng)分化第四天，對照組中細(xì)胞主要分布于G0/G1期;而2BR

18、OP處理組中，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量減少，S期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多。與此同時，我們利用qRT-PCR技術(shù)，檢測了與神經(jīng)分化相關(guān)的CKIs家族成員的表達(dá)情況，借以闡明2BROP阻礙周期退出的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示，與對照組相比，2BROP處理后，分化相關(guān)的CKIs成員的表達(dá)受到不同程度的降低。其中，P57的變化最為明顯。作為對照，細(xì)胞周期增殖標(biāo)記物Ki67的表達(dá)在2BROP處理組中獲得了一定的持續(xù)性高表達(dá)。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示在NSCs

19、分化階段，2BROP處理后，NSCs通過下調(diào)CKIs家族成員，尤其是P57的表達(dá)，從而阻礙細(xì)胞周期的退出與神經(jīng)分化的發(fā)生，使分化狀態(tài)下NSCs自我更新能力獲得明顯的提高。
　　第四部分小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細(xì)胞分化表觀遺傳機(jī)制的作用
　　已知，神經(jīng)分化階段，介導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控的P57的表達(dá)依賴于組蛋白H3、H4的乙?；?。為了檢測組蛋白乙酰化修飾是否參與2BROP介導(dǎo)的神經(jīng)分化，我們利用免疫熒光、Western Bl

20、ot等技術(shù)，檢測NSCs分化階段乙?；M蛋白H3、H4的分布與表達(dá)。結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分化階段時，組蛋白H3與H4的乙?；匠尸F(xiàn)出一定的上升，但是2BROP處理組中組蛋白H3與H4的乙?；矫黠@的低于對照組的水平。為了進(jìn)一步驗(yàn)證組蛋白乙?；揎検欠駞⑴c2BROP介導(dǎo)的神經(jīng)分化，我們使用去組蛋白去乙?；种苿┣啪谹(Trichostatin A，TSA)預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TSA處理后，2BROP抑制神經(jīng)分化的現(xiàn)象得到一定的恢復(fù)。值

21、得注意的是，TSA與2BROP共處理組中，β-tubulinⅢ的表達(dá)甚至高于正常分化組。
　　接下來，我們免疫共沉淀、ELISA等技術(shù)，檢測組蛋白H3、H4乙?；揎椕窹300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，2BROP處理后，P300的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性受到明顯的抑制。同時，我們利用Western Blot、免疫熒光等技術(shù)，檢測了分化階段P300的表達(dá)與分布。結(jié)果顯示，雖然與對照組相比，2BROP處理組中P300的蛋白表達(dá)水平

22、沒有明顯變化，但是P300在胞內(nèi)的分布卻發(fā)生明顯的改變。對照組中，P300主要分布于細(xì)胞核中，而2BROP處理組中P300蛋白遍布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
　　作為脂質(zhì)化修飾方式之一，棕櫚酰化修飾作用參與調(diào)節(jié)蛋白的胞內(nèi)分布、物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白間相互作用等過程。接下來，我們探究2BROP是否通過調(diào)節(jié)P300的棕櫚?；揎梾⑴c調(diào)控組蛋白乙?；揎椗c神經(jīng)分化。首先，我們使用CSS-Palm 4.0軟件預(yù)測P300蛋白是否擁有典型的棕櫚酰化位點(diǎn)。

23、結(jié)果顯示，P300蛋白擁有多個保守性較高的棕櫚?；瘽撛谛揎椢稽c(diǎn)。然后，我們使用ABE方法，檢測NSCs分化階段，對照組與2BROP處理組中P300的棕櫚?；揎椝?。結(jié)果顯示，蛋白P300可以被棕櫚?；揎棧⑶遗c對照組相比，2BROP處理組中P300的棕櫚?；揎椝矫黠@受到抑制，統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示在NSCs分化階段，棕櫚?；揎椡ㄟ^調(diào)節(jié)表觀遺傳關(guān)鍵因子P300的脂質(zhì)化修飾水平，進(jìn)而影響P300的核轉(zhuǎn)

24、位和HAT活性，最終調(diào)節(jié)組蛋白H3、H4的乙酰化水平和分化命運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。
　　結(jié)論：
　　神經(jīng)干細(xì)胞的分化、發(fā)育與成熟是現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。棕櫚?；揎椬饔迷谏窠?jīng)發(fā)育過程中的作用及分子機(jī)制尚未闡明。我們建立P19細(xì)胞定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的體外模型，利用棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑——小分子化合物2BROP，探討棕櫚?；揎椩谏窠?jīng)發(fā)育中的作用及分子機(jī)制。利用P19神經(jīng)定向分化模型，研究發(fā)現(xiàn)，DHHC家族成員分別特異性

25、地表達(dá)于NSCs的增殖和分化階段。并且在這些階段中，許多蛋白發(fā)生了明顯的棕櫚?；揎?。2BROP(10μM)處理后，NSCs增殖的命運(yùn)沒有發(fā)生明顯的改變。但是，在NSCs分化階段，發(fā)現(xiàn)2BROP(10μM)處理后，NSCs的神經(jīng)分化過程和細(xì)胞周期的退出受到阻斷，而NSCs的數(shù)量卻維持在一定的高水平狀態(tài)。進(jìn)一步的檢測，表明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CKI家族中P57的表達(dá)明顯降低。已知，神經(jīng)分化階段，P57的表達(dá)依賴于組蛋白H3/H4的乙酰化水平。

26、當(dāng)加入組蛋白去乙?；种苿┣啪谹(Trichostatin A，TSA)后，發(fā)現(xiàn)P57的表達(dá)和神經(jīng)分化得到一定程度的恢復(fù)。最終，研究表明在神經(jīng)分化階段，2BROP處理后，由于特異性的抑制P300的棕櫚酰化修飾水平，影響其核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而阻礙組蛋白H3/H4的乙?；揎椗c神經(jīng)分化。因此，本研究揭示了一個由基因表達(dá)、表觀遺傳修飾、蛋白翻譯后修飾共同參與的神經(jīng)分化命運(yùn)決定調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究不僅深化了棕櫚酰化修飾在神經(jīng)發(fā)育中的作用，拓展了其分子調(diào)