脂多糖對人牙周膜干細胞一氧化氮表達的影響.pdf

1、目的:
　　 研究人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)在脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激下產(chǎn)生一氧化氮(Nitric oxide,NO)的能力及一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS),干擾素誘導蛋白10(IP-10)的表達情況,為探討牙周膜干細胞在免疫調(diào)節(jié)中的作用機制提供前期研究基礎。
　　 方

2、法:
　　 收集臨床上12-18歲因正畸拔除的健康無齲的前磨牙50例,刮取根中部的牙周膜,采用組織塊直接貼壁培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)hPDLSCs,并進行牙周膜干細胞的鑒定。取對數(shù)生長期的4-8代細胞用于后續(xù)實驗。實驗分為對照組、LPS組(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml)及L-單甲基精氨酸(NG-Monomethyl-L-arginine,Monoacetate Salt,L-

3、NMMA)組(10ng/mlLPS+100μmol/L L-NMMA)。細胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)3h、6h、12h、24h后硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)上清液中NO含量,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IP-10的表達；免疫組化檢測刺激前后牙周膜干細胞iNOS、nNOS、eNOS的表達,RT-PCR檢測細胞中iNOS mRNA的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細胞成功率高,表達人牙周膜干細胞標志STR

4、O-1和CD146,具有骨向和脂肪向等多向分化的潛能,具備干細胞的特性。
　　 2.不同濃度LPS處理hPDLSCs后,hPDLSCs產(chǎn)生的NO的濃度隨時間增加而增加,在24h時達到高峰；hPDLSCs產(chǎn)生的NO的量隨著LPS濃度升高而增加；加入L-NMMA可使NO產(chǎn)生濃度降低(P<0.05)。
　　 3.免疫組化顯示,不同濃度LPS處理hPDLSCs后,iNOS的中度表達,主要表達在hPDLSCs胞漿中,而eNOS、n

5、NOS在未處理組和處理組均見中等程度表達,無顯著差異。L-NMMA和LPS共處理組仍表達iNOS。
　　 4.RT-PCR結(jié)果顯示LPS刺激3h時iNOS mRNA增多。
　　 5.ELISA顯示,不同濃度LPS處理hPDLSCs后,上清液中IP-10的含量隨時間增加而增加,在48h時達到高峰,隨著LPS濃度的增加而降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.LPS作用下,hPDLSCs產(chǎn)生NO的能力在一定時間內(nèi)逐漸