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文檔簡介
1、目的:通過對非COPD不吸煙者(對照組)、非COPD吸煙者(吸煙組)、吸煙COPD患者(COPD組)肺組織表達的蛋白質組進行比較。尋找差異表達蛋白,以期為揭示COPD的發(fā)生、發(fā)展機制提供新的線索。
方法:收集因肺癌行肺葉切除的對照組、吸煙組、COPD組的肺組織標本各24例(其中吸煙組與COPD組的吸煙指數(shù)無顯著性差異),提取組織總蛋白,各組內(nèi)按照隨機每6例構建一個蛋白池。對每一個蛋白池進行雙向凝膠電泳(2-DE),通過對凝膠進
2、行圖像掃描獲取2-DE圖像,利用PDQUEST軟件對3組研究對象的2-DE圖像進行比較分析,識別出差異表達的蛋白質斑點。從凝膠中切取差異表達的蛋白質斑點,TPCK-Trypsin酶解后進行MOLDI-TOF-MS分析,獲取肽質量指紋圖譜,借助于Mascot Distiller/Mascot Wizard軟件進行蛋白質鑒定。對鑒定的部分代表性的蛋白質進行免疫組織化學染色和Western blot檢測,一方面驗證蛋白質組學實驗結果,另一方面
3、對蛋白質的表達進行定位和半定量分析。
結果:
1.對照組、吸煙組、COPD組的肺組織蛋白質組進行2-DE分別分離出775±38、641±33、729±21個蛋白質斑點。通過對3組研究對象的2-DE圖像進行比較分析,共找到表達差異大于1.5倍的蛋白質斑點47個。通過對47個差異表達蛋白質斑點進行質譜分析和數(shù)據(jù)庫鑒定,共鑒定出24種蛋白質,功能主要涉及基本代謝酶類、氧化應激蛋白、凝血/纖溶相關蛋白、蛋白降解相關酶及細胞生
4、長分化相關蛋白等,其中21種蛋白在COPD肺組織蛋白質組學研究中未見報道。與對照組相比,22種蛋白質在吸煙組表達上調(diào),在COPD組表達水平進一步增高。
2.免疫組織化學染色結果顯示:HSP27蛋白表達于肺內(nèi)各種類型細胞,Cathepsin D主要表達于肺泡結構區(qū)域,PPIA及D4-GDI表達于除支氣管上皮細胞以外的各種肺組織細胞,3組間的表達強度變化趨勢與蛋白質組學研究結果一致。
3.Western blot檢測結果
5、顯示:與不吸煙者相比較,HSP27、Cathepsin D、PPIA、D4-GDI在吸煙者肺組織表達上調(diào),COPD患者較非COPD吸煙者表達水平進一步增高。3組間的表達強度變化趨勢與蛋白質組學研究結果一致。
結論:
1.通過對對照組、吸煙組及COPD組進行蛋白質組學比較分析,成功鑒定了24種差異表達的蛋白質,主要為基本代謝酶類、凝血/纖溶相關蛋白質、氧化應激相關酶類、蛋白降解相關酶以及細胞生長分化相關蛋白質。
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