食管鱗癌酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析及MYH9 SiRNA對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景及目的：食管癌的死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中居第四位，超過(guò)90％的食管癌患者是鱗狀細(xì)胞癌。由于大多數(shù)食管癌患者就診時(shí)已處于晚期，因此采用手術(shù)切除為主的綜合治療，其5年生存率仍然很低。研究表明，酪氨酸激酶信號(hào)通路在多種腫瘤中表達(dá)異常，但是由于酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)在組織中的豐度很低，目前尚無(wú)對(duì)食管鱗癌及癌旁正常食管組織(簡(jiǎn)稱癌旁組織，下同)進(jìn)行酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)采用新的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組分析方法，對(duì)食管鱗癌及癌旁組織進(jìn)行差異

2、性酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為揭示酪氨酸激酶信號(hào)通路在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供依據(jù)，同時(shí)為食管鱗癌的治療及早期診斷研究開(kāi)辟新的思路。
　　 方法：
　　 在第一章中我們收集了28對(duì)食管鱗癌及癌旁組織標(biāo)本，采用酪氨酸磷酸化抗體免疫沉淀富集酪氨酸磷酸化多肽，并用LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，將鑒定結(jié)果導(dǎo)入Genepattern軟件進(jìn)行分析，篩選出差異明顯的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)，其中酪氨酸磷酸化差異最為明顯的M

3、YH9(編碼NMⅡA蛋白)，其與DDR1關(guān)系密切。
　　 在第二章中我們提取了MYH9磷酸化水平最高的10例食管鱗癌組織基因組DNA，經(jīng)PCR和測(cè)序檢測(cè)了MYH9基因是否存在相關(guān)位點(diǎn)突變，western blot驗(yàn)證了NMⅡA蛋白在28對(duì)食管鱗癌和癌旁組織中的表達(dá)差異，采用免疫組織化學(xué)的方法研究了50例食管鱗癌組織和30例癌旁組織中NMⅡ A和DDR1的表達(dá)，并與臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 在第三章中我們檢測(cè)了3

4、株食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-140、KYSE-150、KYSE-510的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)譜，比較了人食管鱗癌組織和鱗癌細(xì)胞株酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，同時(shí)為第四章進(jìn)行NMⅡ A蛋白的功能學(xué)研究提供細(xì)胞依據(jù)。
　　 在第四章中，我們應(yīng)用SiRNA沉默MYH9基因，qRT-PCR和westernblot檢測(cè)SiRNA對(duì)NMⅡ A蛋白的沉默水平，細(xì)胞計(jì)數(shù)明確NMⅡ A蛋白沉默對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NMⅡ A蛋白沉默

5、對(duì)細(xì)胞粘附能力的影響，劃痕試驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)NMⅡ A蛋白沉默對(duì)細(xì)胞的平面和3-D遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.在28對(duì)食管鱗癌及癌旁組織中共檢測(cè)到1037種差異性酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)，其中有477種在鱗癌組織中上調(diào)，560種在癌旁組織中上調(diào)。在腫瘤組織中酪氨酸磷酸化水平最高的是MYH9，palladin，APP，DDR1，K105種蛋白，在癌旁組織中酪氨酸磷酸化水平最高的是K23，K20，Sci

6、ellin，envoplakin，EphA15種蛋白。食管鱗癌及癌旁組織中總體酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)無(wú)明顯差異。MYH9的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)是Tyr754和Tyr1408。經(jīng)相關(guān)分析，MYH9與DDR1的關(guān)系密切。
　　 2.測(cè)序結(jié)果顯示MYH9基因的1，10，16,24-26,30-32,35—39等14個(gè)外顯子沒(méi)有檢測(cè)到常見(jiàn)突變位點(diǎn)。Western blot檢測(cè)表明NMⅡ A蛋白在28對(duì)腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織。免疫組化顯示，

7、NMⅡ A蛋白在所有的食管鱗癌組織中表達(dá)，顯著高于癌旁組織(100％ VS26.7％，P=0.000)，其中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)25例(50％)，NMⅡ A的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的侵潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，隨著轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)增加，NMⅡA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加(P=0.015<0.05)，低分化組病例的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率也顯著高于高分化組(P=0.018<0.05)；DDR1蛋白在腫瘤組織中陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織中的陽(yáng)性率(86％ VS

8、30％，P=0.000)，DDR1的表達(dá)僅與腫瘤的侵潤(rùn)深度有關(guān)(P=0.027<0.05)，與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)和腫瘤組織分化程度無(wú)關(guān)。
　　 3.食管鱗癌細(xì)胞株中的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)類型和磷酸化水平與鱗癌組織中的磷酸化類型和水平存在明顯差異；在3株食管鱗癌細(xì)胞株中，只有KYSE-510發(fā)生了動(dòng)力/收縮蛋白的酪氨酸磷酸化，并且磷酸化的動(dòng)力/收縮蛋白只有KLC2，MYH9和dnnactin2三種。三株細(xì)胞株中均有NMⅡ A蛋白的表達(dá)，

9、KYSE-140的表達(dá)相對(duì)較低。
　　 4.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示基因沉默效率在72h SiRNA/轉(zhuǎn)染試劑比例為75ng/1.5ul時(shí)最高，qRT-PCR檢測(cè)提示MYH9 mRNA被SiRNA沉默了89.9％，應(yīng)用MYH9 SiRNA沉默KYSE-510細(xì)胞NMⅡ A蛋白表達(dá)后，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞的增殖速度減慢，體外粘附實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)，細(xì)胞的平面和3-D遷移能力降低(P<0.01)。
　　

10、 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用PhosphoScan技術(shù)對(duì)食管鱗癌及癌旁組織進(jìn)行了酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選出了多個(gè)在食管鱗癌中酪氨酸磷酸化異常增高的蛋白質(zhì)，最明顯的是動(dòng)力/收縮蛋白NMⅡ A和受體型酪氨酸激酶DDR1：
　　 2.食管鱗癌組織中NMⅡ A的高酪氨酸磷酸化可能不是由MYH9基因突變引起，而是與組織中NMⅡ A蛋白的表達(dá)量增高有關(guān)；
　　 3.食管鱗癌組織中NMⅡA的高表達(dá)與食管鱗癌組織的分化和轉(zhuǎn)移