蜜蜂工蜂和雄蜂胚胎期發(fā)育蛋白質(zhì)組及磷酸化蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、在蜜蜂社會(huì)里，工蜂和雄蜂是對(duì)蜂群社會(huì)組織和種群繁衍具有重要貢獻(xiàn)的兩個(gè)綴型。工蜂和雄蜂分別是二倍體和單倍體，二者在遺傳上的差異決定了其生理發(fā)育和社會(huì)行為存在諸多生物學(xué)不同。胚胎發(fā)育期是蜜蜂生命周期中的關(guān)鍵時(shí)期，成年蜂的各種器官雛形都在胚胎期形成。雖然利用基于雙向電泳（2-DE）的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)工蜂和雄蜂胚胎期發(fā)育的分子基礎(chǔ)進(jìn)行初步探索，但只鑒定到105個(gè)蛋白質(zhì)，僅覆蓋了7％的蜜蜂蛋白質(zhì)組（15323個(gè)蛋白質(zhì)），這在一定程度上限制了對(duì)胚胎

2、發(fā)育分子基礎(chǔ)的客觀認(rèn)識(shí)。隨著質(zhì)譜分辨率、靈敏度和精確度技術(shù)的快速發(fā)展，其蛋白質(zhì)鑒定能力至少是2-DE蛋白質(zhì)組的20倍以上。蛋白質(zhì)組覆蓋深度對(duì)全面深入解析蜜蜂胚胎發(fā)育分子基礎(chǔ)至關(guān)重要。磷酸化是最為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，對(duì)蛋白質(zhì)功能具有重要調(diào)節(jié)作用，已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。但利用基于高分辨質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù)對(duì)工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育分子基礎(chǔ)的研究還尚未進(jìn)行。本研究利用基于高分辨質(zhì)譜為主的shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)

3、研究方法、非標(biāo)定量技術(shù)、IMAC（固相金屬離子親和色譜）和TiO2磷酸化蛋白富集等技術(shù)以及蛋白質(zhì)相互作用、激酶預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)分析手段，對(duì)意大利蜜蜂（意蜂）工蜂和雄蜂的胚胎期蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期探明調(diào)控蜜蜂胚胎發(fā)育的關(guān)鍵代謝通路、蛋白質(zhì)和激酶，為蜜蜂胚胎發(fā)育生物學(xué)和對(duì)胚胎發(fā)育機(jī)理的進(jìn)一步研究提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。
　　在意蜂工蜂和雄蜂胚胎期，共鑒定3443個(gè)蛋白質(zhì)，與2-DE的胚胎蛋白質(zhì)相比，鑒定蛋白質(zhì)的覆蓋

4、率提高了30倍以上。盡管蜜蜂胚胎在3個(gè)發(fā)育階段的蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn)差異很大，但是一個(gè)核心蛋白質(zhì)組主要參與蛋白質(zhì)合成、能量代謝、發(fā)育和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的代謝通路對(duì)胚胎發(fā)育發(fā)揮基本的保障功能。1日齡是胚胎發(fā)育的準(zhǔn)備階段，主要功能是提供營(yíng)養(yǎng)和子核分裂，因此胚胎表達(dá)和上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)主要與營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存和核酸代謝相關(guān)，從而保證胚胎細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求和細(xì)胞增殖對(duì)核酸的需求;2-3日齡是器官形成的關(guān)鍵時(shí)期，器官系統(tǒng)在46hr以后逐步形成的，此時(shí)高表達(dá)及上調(diào)表達(dá)的蛋白主

5、要參與細(xì)胞周期、抗氧化、細(xì)胞骨架以及組織形態(tài)發(fā)生等活動(dòng)，為胚胎組織和器官雛形構(gòu)建提供的細(xì)胞代謝保障和分子材料。工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育基本都在3天完成，但雄蜂為了應(yīng)對(duì)自身體型大的發(fā)育需求，形成了不同于工蜂胚胎發(fā)育的策略。雄蜂的胚胎器官形成相關(guān)的代謝通路較工蜂啟動(dòng)早且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，以積累足夠的構(gòu)建器官雛形的分子材料。另外，雄蜂的細(xì)胞骨架系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)功能的加強(qiáng)以滿足胚胎發(fā)育的生理需求。為了探索對(duì)胚胎的基因改造，RNAi的初步結(jié)果表明在胚胎發(fā)育的

6、前48小時(shí)對(duì)基因進(jìn)行沉默的效果較好。
　　應(yīng)用IMAC和TiO2兩種技術(shù)優(yōu)點(diǎn)互補(bǔ)的磷酸化肽段的富集方法，對(duì)工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育進(jìn)行的磷酸化蛋白質(zhì)組分析和激酶預(yù)測(cè)，鑒定到的2438個(gè)胚胎蛋白質(zhì)的6342個(gè)肽段上的6577個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了磷酸化修飾，預(yù)測(cè)了91個(gè)激酶，這是迄今覆蓋度最深的蜜蜂胚胎磷酸化蛋白質(zhì)組研究。在蜜蜂胚胎發(fā)育過程中，磷酸化對(duì)轉(zhuǎn)錄、組織形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞周期調(diào)控/凋亡、細(xì)胞骨架和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路具有重要調(diào)控作用，相應(yīng)CDK、M

7、APK、RSK激酶的持續(xù)表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)合成、組織分化等生命活動(dòng)的進(jìn)行。工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育早期通過一系列PKA激酶調(diào)控能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和組織分化，為細(xì)胞增殖和胚盤形成提供物質(zhì)和能量。胚胎發(fā)育中后期DYRK和CDK亞家族的激酶調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和胚層分化等代謝活動(dòng)，foxO和wnt等通路的激活對(duì)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激、胚層分化、器官形成和背索閉合等過程的完成起決定性作用。磷酸化修飾對(duì)工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育調(diào)控也存在顯著差異。胚胎發(fā)育

8、早期，工蜂mnb激酶對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控以及MAPK3激酶磷酸化的T564位點(diǎn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞骨架進(jìn)程的抑制作用，使工蜂胚胎發(fā)育未被激活，處于初級(jí)發(fā)育階段。而此時(shí)雄蜂胚胎CDK12激酶的充分激活促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，進(jìn)而被激活的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)通路送至核糖體進(jìn)行翻譯，雄蜂已開始大量合成蛋白質(zhì)。胚胎發(fā)育中期，工蜂胚胎CDK1激酶在Y15位點(diǎn)上的磷酸化造成激酶失活，制約了有絲分裂等細(xì)胞周期的進(jìn)行，raf激酶的高度磷酸化限制了與胚胎體軸形成、原腸胚及成蟲盤

9、相關(guān)信號(hào)通路的激活，而雄蜂DCAMKL激酶的高活性和wnt信號(hào)通路的激活全面推進(jìn)了大腦等組織器官的形成。胚胎發(fā)育后期，工蜂胚胎激活的foxO通路為胚胎提供能量和抗氧化保護(hù)，notch、hippo、wnt和hedgehog通路的激活以及CDK9、CDK12和mnb的活性增加和SLK的高磷酸化，推動(dòng)了細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄、翻譯和各種器官構(gòu)建等生命活動(dòng)的進(jìn)行。而雄蜂Abl上S637的磷酸化對(duì)細(xì)胞骨架組織、表皮神經(jīng)分化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控作用