流感嗜血桿菌的耐藥性及同源性研究.pdf

1、背景：
　　流感嗜血桿菌是呼吸道的定植菌。近年來(lái)由于抗菌藥物的廣泛使用,流感嗜血桿菌作為條件致病菌引起的感染率持續(xù)增加,特別是在有病毒感染、外界侵入性操作、使用免疫抑制劑等造成機(jī)體免疫力低下的老年人和兒童中易于引起嚴(yán)重感染,如腦膜炎、菌血癥、社區(qū)獲得性肺炎、急性中耳炎、急性鼻竇炎等。在社區(qū)獲得性肺炎中流感嗜血桿菌是僅次于肺炎鏈球菌的常見(jiàn)病原菌。氨芐西林和環(huán)丙沙星是呼吸道感染的最常用的經(jīng)驗(yàn)藥物。世界各地對(duì)流感嗜血桿菌的耐藥監(jiān)測(cè)中,氨

2、芐西林和復(fù)方新諾明耐藥率不斷上升,且地區(qū)差異較大。β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌的檢出率也在上升。近年國(guó)內(nèi)也有對(duì)喹諾酮耐藥流感嗜血桿菌的報(bào)道,已引起人們的廣泛重視。
　　目前,流感嗜血桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制主要有:產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶有TEM-1和ROB-1型,其中最常見(jiàn)的是TEM-1型。青霉素結(jié)合蛋白改變是β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥的機(jī)制。流感嗜血桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要是喹諾酮耐

3、藥決定區(qū)的突變導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。Gyr基因編碼的DNA促旋轉(zhuǎn)酶和par基因編碼的Ⅳ型拓?fù)洚悩?gòu)酶是氟喹諾酮類藥物作用的靶位,在核酸復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起非常重要的作用。該區(qū)域基因的突變抑制了細(xì)菌的DNA復(fù)制過(guò)程,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。
　　分子生物學(xué)分型有腸桿菌科基因間重復(fù)序列(ERIC-PCR)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)等多種方法,通過(guò)分析細(xì)菌基因組DNA,從遺傳進(jìn)化的角度鑒定菌株的同源性。PFGE具有分辨率強(qiáng)、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn),是分子生物分型的

4、金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)于病原菌監(jiān)測(cè)、追蹤傳染源、找尋傳播途徑等有著非常重要的意義,是監(jiān)測(cè)、控制細(xì)菌的傳播流行的理想工具。
　　目的：
　　了解本地區(qū)流感嗜血桿菌的分布及耐藥情況,了解流感嗜血桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥基因型及分子流行病學(xué)規(guī)律,為臨床抗感染治療提供依據(jù),指導(dǎo)臨床合理用藥。
　　方法：
　　采用k-B紙片法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn),結(jié)果判斷參照2010年臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI20)標(biāo)準(zhǔn)。頭孢硝噻吩玻片法測(cè)定β-

5、內(nèi)酰胺酶。采用PCR擴(kuò)增TEM及ROB型β-內(nèi)酰胺酶基因和喹諾酮耐藥決定區(qū)基因gyrA、gyrB、parC、和parE及4種質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib-cr。脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析菌株同源性。應(yīng)用WHONET5.4軟件分析52株流感嗜血桿菌的分布情況和藥敏結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　從2010年1月到2011年7月,共檢出52株流感嗜血桿菌,其中42株來(lái)自臨床送檢呼吸道標(biāo)本,10株來(lái)自

6、門(mén)診患者。年齡39~85(66±4.9)歲。臨床分離流感嗜血桿菌科室分布以呼吸內(nèi)科為主28例(53.85％),門(mén)診10例(19.23%),其他科室14例(26.92%)。流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥率19.23%,對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為65.38%,氨曲南和阿莫西林/克拉維酸鉀耐藥率11.54%。對(duì)二、三、四代頭孢、氨芐西林/舒巴坦、阿奇霉素、氯霉毒敏感率在90%以上,亞胺培南和哌拉西林/三唑巴坦敏感率100%。10株氨芐西林耐藥菌株均產(chǎn)

7、β-內(nèi)酰胺酶,產(chǎn)酶率為19.23%。
　　PCR基因擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果:10株產(chǎn)酶株均擴(kuò)增出TEM基因,與GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)皆為T(mén)EM-1型。10株產(chǎn)酶株均未擴(kuò)增出ROB基因。收集到2株流感嗜血桿菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥,均擴(kuò)增出gyrA、gyrB、parC和parE基因產(chǎn)物,未擴(kuò)增出質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib-cr。2株環(huán)丙沙星耐藥株同時(shí)產(chǎn)生gyrA基因84位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?8

8、位天冬氨酸突變?yōu)槔野彼岷?株parC基因84位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?1株parC基因未發(fā)生突變。
　　52株流感嗜血桿菌經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳后得到51種帶型,其中有2株僅有一條帶的差別。
　　結(jié)論：
　　本地區(qū)流感嗜血桿菌除對(duì)氨芐西林和復(fù)方新諾明耐藥率較高以外,對(duì)其余臨床常用的抗生素仍保持較好的敏感性。流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制為產(chǎn)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶。本地區(qū)流感嗜血桿菌對(duì)喹諾酮耐藥可能與gyrA和parC基因突