腺病毒介導(dǎo)野生型p53基因轉(zhuǎn)染左向右流型肺動(dòng)脈高壓大鼠的試驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因轉(zhuǎn)染左向右分流型先心病肺動(dòng)脈高壓大鼠，觀察轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá)情況，及其對(duì)肺動(dòng)脈高壓的抑制作用和對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法:將pCMVp53重組轉(zhuǎn)移載體經(jīng)BamH1和NheI酶切，得到p53基因cDNA，然后將cDNA片段克隆到轉(zhuǎn)移載體pCMV5GFP，使其受CMV5啟動(dòng)子的調(diào)控，獲得pCMV5p53重組轉(zhuǎn)移載體，用該線狀重組轉(zhuǎn)移載體與腺病毒右臂DNA經(jīng)磷酸鈣共轉(zhuǎn)染293

2、細(xì)胞獲得重組腺病毒，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定p53蛋白含量，證明外源p53基因在含重組腺病毒的293細(xì)胞中得到表達(dá)。同法創(chuàng)建對(duì)照組病毒Adeno-lacZ。48只大鼠隨機(jī)分為4組：Ⅰ組(n=10)為空白對(duì)照組，僅做假手術(shù)處理；Ⅱ組(n=13)為模型對(duì)照組，通過(guò)套管法建立左向右分流型PH模型：Ⅲ組(n=14)為實(shí)驗(yàn)組，建立PH模型，并通過(guò)氣管吸入法轉(zhuǎn)染Adeno-p53重組腺病毒；Ⅳ組(n=1.1)為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，建立PH模型，并

3、通過(guò)氣管吸入法轉(zhuǎn)染Adeno-lacZ重組腺病毒。16周后右心導(dǎo)管法測(cè)量各組大鼠右室平均壓(mRVP)和肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)及RV/BW，評(píng)估野生型p53基因?qū)δＰ痛笫笱鲃?dòng)力學(xué)的影響，HE染色觀察小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)、測(cè)量小動(dòng)脈管徑及管壁厚度計(jì)算WT％，Ⅲ、Ⅳ組Western blot法鑒定p53基因產(chǎn)物在肺組織中的表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)方法研究肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PCNA的表達(dá)，并通過(guò)原位缺口末端標(biāo)記方法(TU

4、NEL)檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡，分別計(jì)算增殖指數(shù)(PI)、凋亡指數(shù)(AI)及PI/AI。 結(jié)果:Ⅰ.Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的mRVP、mPAP及WT％均明顯高于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅳ組RVHI明顯高于Ⅰ組(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組的mPAP、mPVP、RVHI及WT％明顯降低(P<0.05)，但與Ⅰ組相比，Ⅲ組的mPAP、mPVP及WT％仍明顯高于Ⅰ組(P<0.05)；與Ⅳ組相比，Ⅲ組的各項(xiàng)指標(biāo)均低于Ⅳ組(P<0.0

5、5)。HE染色標(biāo)本上可見(jiàn)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組肺動(dòng)脈肌層及內(nèi)膜均有不同程度的增厚以及肺小動(dòng)脈肌化管腔狹窄；而Ⅱ組血管內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)，管壁薄，厚度均勻一致。 2.Western blot結(jié)果示Ⅲ組出現(xiàn)特異性條帶，提示目的基因已成功表達(dá)功能蛋白。 3.轉(zhuǎn)染野生型p53基因的Ⅲ組，PI明顯低于Ⅱ組與Ⅳ組(P<0.05)，AI明顯增高，高于其他三組(P<0.05)，PI/AI明顯低于Ⅱ組與Ⅳ組(P<0.05)。 結(jié)論: