攜帶p53基因雙重調(diào)控增殖型腺病毒CNHK600-p53治療肝癌的實驗研究.pdf

1、病毒療法即利用病毒治療腫瘤的概念最早產(chǎn)生于十九世紀，因為人們發(fā)現(xiàn)有的腫瘤患者在受到病毒感染或注射疫苗后出現(xiàn)腫瘤暫時消失的現(xiàn)象。其后許多不同的病毒作為溶瘤制劑開始進行臨床試驗，但由于所用病毒效率低、毒性高使人們屢遭挫折。隨著病毒學、分子生物學及腫瘤學的飛速發(fā)展，人們對病毒的基因結(jié)構(gòu)和功能進行了較為詳細的研究，有效地對病毒基因進行了改造，使改造后的病毒能在腫瘤細胞中特異性增殖，而在正常細胞內(nèi)不增殖。這樣病毒一旦感染腫瘤細胞即可在細胞內(nèi)增殖并

2、裂解腫瘤細胞，細胞裂解后釋放的病毒顆粒再次感染其它腫瘤細胞，直到將腫瘤細胞全部殺滅。近年來已有近十種增殖病毒進入臨床研究，其中最引人注目的腫瘤特異性增殖病毒是美國ONYX藥物公司研究的E1B55KD缺陷的增殖型腺病毒(ONYX-015)，它利用腫瘤細胞中p53基因突變而正常細胞中p53正常的差異使病毒在腫瘤細胞中特異性增殖。目前該病毒已進入Ⅲ期臨床試驗。與傳統(tǒng)化療聯(lián)用，ONYX-015的有效率在50％以上，這是至今為止應用于臨床的最有效

3、的生物治療手段。但是，單用該病毒療效甚微，有效率＜20％，所以必須放化療聯(lián)合應用才能有效的殺傷腫瘤。p53基因是重要的腫瘤抑制基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤病人的預后關(guān)系密切。超過50％以上的腫瘤存在p53基因的異常，因此野生型p53基因?qū)氤蔀橹匾哪[瘤治療手段。但該方法存在著許多不足，例如在體內(nèi)半壽期短，需要反復注射。而且，基因治療中常用的載體也存在著轉(zhuǎn)染率低、表達量少及靶向性差等缺點。為此我們設想應用上面介紹的腫瘤特異性增殖型腺

4、病毒攜帶某種對腫瘤治療有明確療效的抗癌基因，利用這類病毒在腫瘤細胞內(nèi)特異性增殖及復制，而在正常細胞內(nèi)不增殖的特點，從而使包括p53在內(nèi)的抗癌基因在腫瘤細胞內(nèi)特異性高效表達，這種結(jié)合病毒治療與基因治療優(yōu)點的新型治療方案稱為基因病毒治療法。 本實驗將p53基因插入增殖型腺病毒CNHK600，構(gòu)建攜帶p53基因的增殖性腺病毒CNHK600-p53，該病毒缺失E1A中與Rb蛋白結(jié)合的基因序列，保留使腺病毒有效逃避宿主免疫監(jiān)視及有效裂解宿

5、主細胞而釋放子代病毒的E3區(qū)，用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子及缺氧反應(HRE)啟動子來分別調(diào)控腺病毒的E1A及E1B基因，從而使病毒的復制更準確地靶向腫瘤細胞，力圖達到廣譜、特異、安全、高效的抗癌效果。通過體外實驗對CNHK600-p53選擇性殺傷腫瘤細胞的能力進行評估。 [實驗方法與結(jié)果]一、攜帶p53基因的增殖腺病毒CNHK600-p53的構(gòu)建和制備全基因合成p53基因，進行PCR體外擴增，回收大小為1179bp的

6、DNA片段，用ECORⅠ和XbaⅠ酶切后裝入通用載體pUC19，得到pUC19-p53，進行測序，確保p53基因擴增正確。將pUC19-p53應用內(nèi)切酶ECORⅠ和XbaⅠ進行酶切，與ECORⅠ和NheⅠ(與XbaⅠ是同尾酶)酶切后的pClon17連接，得到pClon17-p53。再應用AgeⅠ和NotⅠ將該載體在403bp和2872bp處切開，回收2469bpDNA片段，該片段含有CMV啟動子+p53基因+SV40poly-A加尾信號

7、。將該片段插入CNHK600載體中，得到CNHK600-p53載體。利用Lipofectamine2000試劑盒，將質(zhì)粒CNHK600-p53與和5型腺病毒骨架載體ppE3共轉(zhuǎn)染至293細胞，p53基因被插入到腺病毒基因組的E1區(qū)。轉(zhuǎn)染后9-14天細胞出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，提取病毒DNA進行PCR鑒定，正確重組病毒命名為CNHK600-p53。將病毒在293細胞中反復擴增，通過氯化銫梯度離心法純化病毒，用TCID50方法測

8、得重組腺病毒滴度達到1.99×1010pfu/ml。 二、攜帶p53基因的增殖腺病毒CNHK600-p53體外抗腫瘤療效觀察1.病毒增殖實驗：用重組腺病毒CNHK600-p53感染不同來源的腫瘤細胞株，觀察不同時相(0h、48h和96h)的病毒增殖情況，實驗表明CNHK600-p53在多種實體瘤細胞中均顯示出良好的增殖力，在肝癌細胞株SMMC-7721和HepGII中96h的增殖倍數(shù)分別高達10000±567和3160±354倍

9、，。但在人正常肝細胞L02中幾乎不增殖(96h的增殖倍數(shù)分別為50.5±5.2倍)，證明該病毒具有良好的腫瘤靶向性及安全性。 2.四甲基偶氮唑鹽比色實驗(MTT)：與Ad-p53相比，CNHK600-p53能在很低濃度將腫瘤殺死。兩種病毒對不同癌細胞的半殺傷劑量IC50及90％殺傷劑量IC90的結(jié)果更是直觀地表明CNHK600-p53對各種癌細胞的殺傷力遠遠高于Ad-p53，其中IC50為110.18-9500倍，IC90為24

10、.70-8738.33倍。以對兩個病毒最為敏感的肝癌細胞Hep3B為例，CNHK600-p53達到IC90的MOI值為0.06±0.02，而Ad-p53為542.33±71.84。 三、增殖性腺病毒CNHK600-p53和化療藥(5氟尿嘧啶、絲裂霉素、表阿霉素)協(xié)同作療效觀察我們發(fā)現(xiàn)CNHK600-p53和化療藥有較好的協(xié)同作用，以BEL-7404細胞株為例，我們發(fā)現(xiàn)CNHK600-p53(MOI=10)和化療藥聯(lián)合較單用化療藥

11、，可明顯提高其療效。 [結(jié)論]1.成功構(gòu)建攜帶p53基因的雙調(diào)控增殖型腺病毒CNHK600-p53。 2.體外實驗表明重組病毒CNHK600-p53可以選擇性地在腫瘤細胞中增殖、殺傷，殺傷力明顯優(yōu)于增殖缺陷型腺病毒Ad-p53，而在正常細胞中基本不增殖。 3.CNHK600-p53聯(lián)合化療藥物后腫瘤細胞抑制率明顯增高。 4.CNHK600-p53是一種廣譜、特異、安全、高效的溶瘤病毒，可能為肝癌等實體瘤的