SUN1-2對(duì)斑馬魚(yú)集中延伸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)及其機(jī)制的研究.pdf

1、SUN結(jié)構(gòu)域蛋白（SAD1/UNC84 domain containing protein）是一類C端含有保守SUN結(jié)構(gòu)域的蛋白，該結(jié)構(gòu)域與釀酒酵母中的SAD1蛋白和線蟲(chóng)中UNC-84蛋白有很高的同源性。目前，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的SUN結(jié)構(gòu)域蛋白至少有四個(gè)，包括SUN1、SUN2、SUN3和SPAG4。其中SUN1和SUN2在哺乳動(dòng)物各組織中廣泛表達(dá)，SUN3和SPAG4表達(dá)較少。在結(jié)構(gòu)上，哺乳動(dòng)物中SUN1和SUN2蛋白的N端均定位于

2、細(xì)胞核內(nèi)，與核纖層蛋白相互連接，而其包含SUN結(jié)構(gòu)功能域的C端則定位于雙層核膜之間，通過(guò)Nesprin蛋白與細(xì)胞骨架相連。SUN1/2蛋白通過(guò)這種結(jié)構(gòu)形成LINC(linker of nucleoskeleton and cytoskeleton)復(fù)合體，直接與細(xì)胞骨架和核骨架相連接，因此SUN1/2蛋白被認(rèn)為在細(xì)胞核定位和遷移上具有非常重要的作用。
　　 研究表明，Sun1/2雙敲小鼠(Sun1-/-;Sun2-/-)在胚胎發(fā)

3、育早期死亡，提示SUN1/2蛋白可能在早期胚胎發(fā)育中起到極其重要的作用。雖然SUN1/2蛋白在核定位和遷移中的功能已經(jīng)有所報(bào)道，但是其在胚胎早期發(fā)育特別是原腸運(yùn)動(dòng)中的作用還沒(méi)有相關(guān)研究。原腸運(yùn)動(dòng)是斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中三胚層形成的重要過(guò)程，其中集中延伸運(yùn)動(dòng)是其最主要的程序，它對(duì)于斑馬魚(yú)體軸的形成和延長(zhǎng)起關(guān)鍵作用。在脊椎動(dòng)物中，集中延伸運(yùn)動(dòng)主要受到平面細(xì)胞極性途徑（Wnt/Planar Cell Polarity pathway，Wnt

4、/PCP）的調(diào)節(jié)，它對(duì)于細(xì)胞的遷移以及胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的內(nèi)卷內(nèi)嵌等過(guò)程都起到顯著的調(diào)節(jié)作用。本課題通過(guò)在斑馬魚(yú)胚胎1-4細(xì)胞期注射嗎啉反義寡聚核苷酸（Morpholino，MO），特異性抑制SUN1和SUN2蛋白的表達(dá)，研究其在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 第一部分Sun1/2基因在斑馬魚(yú)早期胚胎中的表達(dá)
　　 為探討SUN1/2蛋白在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育中的功能，我們首先采用胚胎整封原位雜交和RT-PC

5、R的方法，檢測(cè)了Sun1/2基因在斑馬魚(yú)發(fā)育早期的時(shí)空表達(dá)情況。原位雜交結(jié)果顯示，Sun1和Sun2基因在胚胎8細(xì)胞期已經(jīng)表達(dá)，為母源性表達(dá)，且在斑馬魚(yú)胚胎呈現(xiàn)泛表達(dá);RT-PCR結(jié)果顯示，Sun1在斑馬魚(yú)胚胎30％下包期表達(dá)較高，而Sun2在胚胎30％下包至尾芽期均呈現(xiàn)高表達(dá)。以上結(jié)果提示，SUN1/2可能在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育原腸運(yùn)動(dòng)中起到重要作用。
　　 第二部分SUN1/2對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育集中延伸運(yùn)動(dòng)的影響
　　

6、 為研究SUN1/2蛋白在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的作用，我們采用胚胎早期顯微注射MO的方法，特異性抑制SUN1/2蛋白的表達(dá)，并觀察對(duì)于胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)抑制SUN1或SUN2的表達(dá)，沒(méi)有對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響，而同時(shí)抑制SUN1/2的表達(dá)，胚胎表現(xiàn)出前后體軸縮短、尾部彎曲、體節(jié)部位變寬等表型，且呈現(xiàn)出一定程度的MO劑量依賴性。由此提示SUN1/2蛋白存在功能上的冗余，而同時(shí)抑制SUN1/2蛋白的表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育中的原腸

7、運(yùn)動(dòng)造成影響。為進(jìn)一步確認(rèn)抑制SUN1/2蛋白的表達(dá)是否對(duì)斑馬魚(yú)胚胎原腸運(yùn)動(dòng)中極其重要的集中延伸運(yùn)動(dòng)造成影響，我們采用胚胎整封原位雜交技術(shù)，檢測(cè)了集中延伸運(yùn)動(dòng)相關(guān)標(biāo)記基因ntl、hgg1、dlx3b、tbx6、myod1、krox20等的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，抑制SUN1/2蛋白表達(dá)后，胚胎集中延伸相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)均出現(xiàn)明顯異?；虍愇唬砻饕种芐UN1/2表達(dá)后，胚胎發(fā)育中的軸向中胚層、軸旁中胚層、神經(jīng)外胚層發(fā)育均出現(xiàn)缺陷，胚胎集中延伸運(yùn)

8、動(dòng)受到嚴(yán)重影響。由此可見(jiàn)，SUN1/2蛋白在斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育的集中延伸運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 第三部分SUN1/2對(duì)斑馬魚(yú)集中延伸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究
　　 哺乳動(dòng)物中的研究證實(shí)，SUN1/2蛋白對(duì)于核孔復(fù)合體在核膜上正常分布很重要，而脊椎動(dòng)物原腸運(yùn)動(dòng)中的細(xì)胞遷移與β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布相關(guān)。為研究SUN1/2蛋白是否通過(guò)影響β-catenin蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)集中延伸運(yùn)動(dòng)，我們收集注射MO

9、的斑馬魚(yú)胚胎，分離核蛋白及胞漿蛋白，采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)β-catenin蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的分布變化。結(jié)果顯示，注射SUN1/2 MO并未影響β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，提示抑制SUN1/2蛋白的表達(dá)并未影響核孔復(fù)合體的核轉(zhuǎn)運(yùn)功能。此外，脊椎動(dòng)物中，集中延伸運(yùn)動(dòng)主要受到Wnt/PCP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。為研究抑制SUN1/2表達(dá)后是否影響Wnt/PCP信號(hào)通路，我們采用蛋白免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)了關(guān)鍵因子P-JNK蛋白表達(dá)情

10、況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制SUN1/2蛋白表達(dá)后，P-JNK表達(dá)明顯降低。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了Wnt/PCP信號(hào)通路下游靶基因liv1和stat3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示抑制SUN1/2表達(dá)后，liv1和stat3表達(dá)有所下調(diào)。這些結(jié)果表明，SUN1/2通過(guò)Wnt/PCP信號(hào)通路調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)集中延伸運(yùn)動(dòng)，對(duì)于進(jìn)一步深入的調(diào)節(jié)機(jī)制有待于繼續(xù)研究。
　　 總之，通過(guò)本研究我們發(fā)現(xiàn)，SUN1/2蛋白通過(guò)Wnt/PCP信號(hào)