PD-1核心啟動(dòng)子的定位及活性檢測(cè).pdf

1、丙型肝炎是一種流行較為廣泛的病毒性疾病，是一個(gè)對(duì)社會(huì)及經(jīng)濟(jì)有重要影響的全球問(wèn)題。我國(guó)HCV感染者約4100萬(wàn)，流行率已達(dá)總?cè)丝诘?.2％。而且，每年有300～400萬(wàn)新發(fā)病例[1]。丙型肝炎慢性化的發(fā)生機(jī)制尚未明確，但有證據(jù)表明，免疫耐受是關(guān)鍵其因素之一[2]。
　　PD-1在HCV慢性感染患者體內(nèi)表達(dá)升高并且與HCV的慢性化密切相關(guān)，但其機(jī)理尚未得以闡明?；虻霓D(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)的第一步，也是受到嚴(yán)格控制的一步，它對(duì)了解一個(gè)基因

2、的表達(dá)水平至關(guān)重要，而且已有許多成熟的方法可以使人們對(duì)此進(jìn)行研究，而啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用是轉(zhuǎn)錄起始階段調(diào)控的重點(diǎn)環(huán)節(jié)，故我們決定從PD-1啟動(dòng)子研究入手來(lái)尋找PD-1在慢性感染疾病進(jìn)程中高表達(dá)的原因。
　　本研究首先獲取PD-1基因的全序列，然后利用生物信息學(xué)在線分析查找PD-1啟動(dòng)子在該基因全序列中的可能位置。將PD-1啟動(dòng)子全長(zhǎng)克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中，轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，利用熒光素酶活性檢測(cè)手

3、段確定PD-1啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄活性。然后根據(jù)PD-1啟動(dòng)子序列，以3’區(qū)為核心，向5’方向設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的截短體。后者分別被克隆入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中，根據(jù)熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果，尋找其中能使熒光素酶產(chǎn)生最強(qiáng)活性的截短體，即為PD-1核心啟動(dòng)子序列。
　　我們首先從GENEBANK上獲得PD-1基因(GeneID:5133)的全序列，利用生物信息學(xué)手段，找到PD-1基因調(diào)控區(qū)得分最高的七個(gè)順式作用元件Mef2、E

4、RE、GATA、TEF、TATA、GATA和ERE。同時(shí)經(jīng)過(guò)分析確定PD-1mRNA序列第一外顯子上游1500bp及下游150bp共1650bp核苷酸為其啟動(dòng)子所在區(qū)域。將啟動(dòng)子全長(zhǎng)克隆到熒光報(bào)告基因載體pGL3-basic中，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)，確定該啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。然后以PD-1基因啟動(dòng)子3’端為核心，向5’方向設(shè)計(jì)七個(gè)不同長(zhǎng)度的截短體(1650bp、1450bp、1250bp、1128bp、874bp、674bp、47

5、4bp和274bp)，并將其分別克隆到熒光報(bào)告基因載體pGL3-basic中。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，pGL3-1128所在細(xì)胞的熒光素酶活性最高，說(shuō)明該截短體的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)，故而認(rèn)為PD-1的核心啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)?978bp～+150bp(1128bp)。
　　在此基礎(chǔ)上我們擬進(jìn)一步確定與PD-1的核心啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并研究這些轉(zhuǎn)錄因子與HCV感染慢性化的關(guān)系。該研究對(duì)于闡明HCV慢性化的機(jī)理具有重要意義，同時(shí)也可能為臨床上