p53過表達(dá)對(duì)Ki-67基因核心啟動(dòng)子活性的影響.pdf

1、目的：鑒定p53過表達(dá)對(duì)Ki-67基因核心啟動(dòng)子活性的影響并探索其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：使用ICH和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)p53對(duì)Ki-67基因表達(dá)的影響；雙熒光素酶活性檢測(cè)技術(shù)鑒定48小時(shí)內(nèi)Ki-67基因核心啟動(dòng)子活性變化趨勢(shì)以及p53過表達(dá)對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響；瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p53過表達(dá)對(duì)Sp1所介導(dǎo)的Ki-67基因核心啟動(dòng)子活性上調(diào)的影響；ConTra啟動(dòng)子同源性分析系統(tǒng)檢測(cè)Ki-67基因核心啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)

2、合位點(diǎn)；定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建p53結(jié)合模序和Sp1結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變質(zhì)粒；瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性檢測(cè)技術(shù)鑒定Ki-67基因核心啟動(dòng)子區(qū)p53結(jié)合模序和Sp1結(jié)合位點(diǎn)在p53過表達(dá)所介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性抑制中的作用。
　　 結(jié)果：p53過表達(dá)顯著抑制Ki-67基因的表達(dá)。48小時(shí)內(nèi)Ki-67基因核心啟動(dòng)子的活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，其中在24小時(shí)時(shí)達(dá)高峰。p53以劑量依賴的方式下調(diào)Ki-67基因核心啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄活性。ConTra

3、啟動(dòng)子同源性分析系統(tǒng)在Ki-67基因核心啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到兩個(gè)p53結(jié)合模序。定點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建出3個(gè)p53結(jié)合模序突變質(zhì)粒和3個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒。p53結(jié)合模序突變后的Ki-67核心啟動(dòng)子活性較突變前有所上調(diào)，但仍受p53的抑制。p53以劑量依賴的方式抑制Sp1介導(dǎo)的Ki-67基因核心啟動(dòng)子活性的上調(diào)。隨著核心啟動(dòng)子中Sp1突變位點(diǎn)數(shù)目的增加，Ki-67基因核心啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，而p53對(duì)其的抑制作用也相應(yīng)減弱，當(dāng)3個(gè)

4、Sp1結(jié)合位點(diǎn)全部突變后p53幾乎失去了對(duì)其的轉(zhuǎn)錄抑制活性；當(dāng)核心啟動(dòng)子區(qū)的第一個(gè)和第三個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)突變后，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性較突變前有所上調(diào)。
　　 結(jié)論：p53過表達(dá)通過p53和Sp1依賴的途徑抑制Ki-67基因核心啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)Ki-67基因的表達(dá)：1．p53通過與p53結(jié)合模序的序列特異性相互作用發(fā)揮對(duì)Ki-67基因核心啟動(dòng)子的部分轉(zhuǎn)錄抑制活性；
　　 2．Ki-67基因核心啟動(dòng)子區(qū)的第1個(gè)和第3個(gè)