Necroptosis在脊髓損傷后的表達(dá)及作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立胸10節(jié)段挫傷的大鼠模型，檢測necroptosis關(guān)鍵蛋白在脊髓損傷(SCI)后隨時(shí)間變化而發(fā)生的動(dòng)態(tài)表達(dá)，及發(fā)生necroptosis的細(xì)胞類型。采用其特異性抑制劑necrostatin-1（Nec-1）進(jìn)行干預(yù)，觀察其對SCI大鼠模型的影響，同時(shí)對內(nèi)在的分子機(jī)制進(jìn)行探索，來初步確定necroptosis在SCI急性期病理改變中的作用。
　　方法:SD大鼠共計(jì)一百四十四只，分成四組:(1) Sham組:剪除椎板，無脊

2、髓的損傷;(2) SCI組:只損傷脊髓，不給任何藥物處理;(3) SCI+Nec-1組:打擊脊髓前15min，鞘內(nèi)注射Nec-1(20uL，40mg/mL);(4) SCI+溶劑組(SCI+Veh組):損傷脊髓前給予同等劑量Nec-1的溶劑(DMSO與0.9％的NaCI等體積混合)。其中SCI組根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)分為多個(gè)亞組，用于檢測necroptosis相關(guān)蛋白RIP1和RIP3的動(dòng)態(tài)表達(dá)。采用的實(shí)驗(yàn)方法主要有(1) PI標(biāo)記+免疫熒光:

3、觀察發(fā)生necroptosis的細(xì)胞種類;(2)TTC染色:顯示SCI后24h脊髓的血供狀態(tài);(3)伊文氏藍(lán)滲透實(shí)驗(yàn):觀察損傷24h后血-脊髓屏障通透性的改變;(4)Western-blot:觀察各種蛋白水平的變化;(5) ELISA:脊髓局部炎癥相關(guān)因子的濃度測定;(6)感覺及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評價(jià)。
　　結(jié)果:(1)SCI后necroptosis存在時(shí)空變化: RIP1和RIP3的表達(dá)均上調(diào)均于損傷后48h達(dá)到高峰，且與凋亡相關(guān)的c

4、leaved caspase-3和自噬標(biāo)志蛋白LC3BⅡ的表達(dá)峰值時(shí)間點(diǎn)一致。免疫熒光結(jié)果表明，MAP-2、GFAP及Olig2與PI均有共定位的情況出現(xiàn)。(2) Nec-1預(yù)處理可以減輕損傷造成的組織結(jié)構(gòu)破壞，主要表現(xiàn)為SCI+Nec-1組脊髓組織病理評分顯著低于SCI組，損傷1w后前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量顯著多于SCI組，脫髓鞘改變得到緩解。(3) Nec-1預(yù)處理可以促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，主要表現(xiàn)為SCI+Nec-1組的BBB評分從損

5、傷后1w開始明顯高于SCI組。(4) Nec-1預(yù)處理可以通過多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用:(a)減輕損傷造成的脊髓水腫，表現(xiàn)為SCI+Nec-1組的濕/干比重明顯低于SCI組;(b)改善脊髓的微循環(huán):SCI+Nec-1組脊髓組織內(nèi)伊文氏藍(lán)含量顯著低于SCI組，前一組的脊髓缺血面積明顯小于后一組;(c) Nec-1干預(yù)可以同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:Necroptosis在大鼠SCI后病理演變過程中發(fā)揮了重要的作