1、Omentin-1對(duì)人成骨細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究2、Ghrelin對(duì)OPG基因敲除小鼠動(dòng)脈鈣化的影響.pdf

1、第一部分Omentin-1對(duì)人成骨細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究
　　目的:網(wǎng)膜素(Omentin-1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種主要由網(wǎng)膜脂肪組織分泌的脂肪因子，研究表明Omentin-1參與調(diào)控胰島素敏感性、心血管功能、炎癥反應(yīng)及骨代謝等生理過(guò)程。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)Omentin-1在護(hù)骨素(OPG)基因敲除或卵巢切除的小鼠中通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮骨保護(hù)作用。但是關(guān)于Omentin-1對(duì)人成骨細(xì)胞(hOB)增殖的作用及相關(guān)機(jī)制的研究

2、仍較少，本研究旨在檢測(cè)Omentin-1對(duì)hOB增殖的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:原代hOB取材于人的松質(zhì)骨，用不同濃度Omentin-1(25，50，100，200ng/ml)干預(yù)48h，用[3H]胸腺嘧啶核苷酸摻入法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的水平;Western Blot檢測(cè)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)下游底物Akt的活化;通過(guò)小分子干擾核糖核酸(siRNA)技術(shù)阻斷Akt，聯(lián)合PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑LY294002和Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻

3、斷劑HIMO干預(yù)hOB后，觀察Omentin-1對(duì)hOB增殖及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響。
　　結(jié)果:25～200ng/ml Omentin-1能促進(jìn)hOB增殖，且呈濃度依賴效應(yīng)，Omentin-1濃度為200ng/ml時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖呈最大效應(yīng);Omentin-1能誘導(dǎo)Akt的活化，將Akt-siRNA轉(zhuǎn)染至hOB后可阻斷Akt蛋白的表達(dá);此外，Akt-siRNA, LY294002和HIMO均可阻斷Omentin-1的促成骨細(xì)胞增殖的

4、效應(yīng)。
　　結(jié)論: Omentin-1能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)hOB增殖。
　　第二部分Ghrelin對(duì)OPG基因敲除小鼠動(dòng)脈鈣化的影響
　　目的:Ghrelin是一種由28個(gè)氨基酸組成的多肽，在體內(nèi)發(fā)揮著促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放，刺激攝食，調(diào)節(jié)能量代謝等方面的作用。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)向成骨樣細(xì)胞分化是動(dòng)脈鈣化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/細(xì)胞核因子κB受體

5、活化因子配基(ERK/RANKL)和Akt/RANKL信號(hào)通路抑制小鼠VSMCs向成骨樣細(xì)胞分化，本研究探討Ghrelin對(duì)OPG基因敲除(OPG-/-)小鼠動(dòng)脈鈣化的影響。
　　方法:OPG-/-小鼠每?jī)芍芙?jīng)尾靜脈注射Ghrelin adenovirus(Ad-Ghr)或β-galactosidase adenovirus(Ad-Gal)或PBS，并分別分為Ghrelin組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，野生型(WT)小鼠每?jī)芍芙?jīng)尾靜

6、脈注射PBS作為WT組，8周后處死老鼠，分離鼠胸主動(dòng)脈，western blot檢測(cè)Ghrelin表達(dá);茜素紅染色及Vonkossa染色測(cè)定血管的鈣化程度;分離主動(dòng)脈弓到髂骨分支的動(dòng)脈，比色法測(cè)動(dòng)脈血管壁鈣含量，對(duì)硝基苯酚法測(cè)動(dòng)脈血管壁堿性磷酸酶(ALP)活性;免疫組化檢測(cè)動(dòng)脈血管壁骨鈣素(OC)、RANKL及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)的表達(dá)。
　　結(jié)果:Ghrelin組小鼠Ghrelin的表達(dá)較其余三組的明顯升高，說(shuō)明

7、Ghrelin腺病毒載體使小鼠成功過(guò)表達(dá)Ghrelin;茜素紅和Vonkossa鈣化染色均顯示W(wǎng)T組小鼠未見明顯鈣化，Ghrelin組小鼠動(dòng)脈僅出現(xiàn)輕度鈣化，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組動(dòng)脈出現(xiàn)明顯鈣化;與WT小鼠相比，OPG-/-小鼠主動(dòng)脈血管壁鈣含量及ALP活性明顯升高，Ghrelin組小鼠動(dòng)脈血管壁的鈣含量及ALP活性較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的明顯降低。免疫組化提示與WT小鼠相比，OPG-/-小鼠動(dòng)脈血管壁的OC、RANKL、RUNX2