轉(zhuǎn)膠蛋白Transgelin誘導(dǎo)人前列腺癌細胞系LNCαP凋亡和衰老的初步研究.pdf

1、本文對轉(zhuǎn)膠蛋白Transgelin誘導(dǎo)人前列腺癌細胞系LNCαP凋亡和衰老進行了研究。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：觀察轉(zhuǎn)膠蛋白對肌動蛋白更新的影響。
　　 目的：研究轉(zhuǎn)膠蛋白對肌動蛋白更新、細胞ROS水平的影響，并進一步觀察其對DNA損傷傳導(dǎo)途徑和細胞衰老的影響。
　　 方法：將轉(zhuǎn)膠蛋白轉(zhuǎn)染至人前列腺癌細胞株LNCaP，檢測細胞絲狀肌動蛋白(F-actin)和球狀肌動蛋白(G-actin)的變化，并檢測

2、細胞內(nèi)ROS水平的變化。通過8-OH-dG、phospho-ATM和γH2AX免疫熒光染色觀察DNA損傷情況，進一步通過Westernblotting檢測DNA損傷傳導(dǎo)途徑ATM(Ataxia-Telangiectasia Mutated)-Chk2(checkpoint kinase2)-p53的變化。通過Heterochromatin proteinl(HP1)免疫熒光染色、western blotting和半乳糖苷酶細胞(β-ga

3、l)化學(xué)染色等方法，觀察外源性轉(zhuǎn)膠蛋白和內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白分別對LNCaP和MRC5細胞染色質(zhì)重構(gòu)及細胞衰老的影響。同時，通過SiRNA抑制人骨肉瘤細胞株U2OS內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白的表達，觀察細胞F-actin、G-actin的變化和ROS的變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細胞后24h，細胞F-actin增加明顯，G-actin無明顯變化，細胞內(nèi)ROS水平升高；轉(zhuǎn)染U2OS細胞Si-transgelin RNA48h后，轉(zhuǎn)膠

4、蛋白水平明顯下降，細胞F-actin下降，ROS水平下降。LNCaP轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，免疫熒光染色提示細胞核出現(xiàn)8-OH-dG陽性染色，phospho-ATM熒光強度增加及γH2AX簇集的增多。Western blotting提示ATM-Chk2-p53途徑的激活。HP1免疫熒光染色提示LNCaP細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，細胞衰老相關(guān)的異染色質(zhì)簇集(Senescence-associated heterochromatin Foci，SAHF)

5、增多，western blotting提示HP1γ表達水平上升較明顯，acetyl-H3表達下降。β-半乳糖苷酶細胞化學(xué)染色提示轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白36 h后，陽性細胞數(shù)增多。HP1免疫熒光染色和western blotting提示MRC5高代細胞轉(zhuǎn)膠蛋白表達量較低代細胞多，同時SAHF也較低代細胞多。低代MRC5細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，β-半乳糖苷酶陽性細胞增加。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)膠蛋白通過促進LNCaP細胞F-actin聚集，可使細胞發(fā)生

6、DNA氧化損傷和DNA斷裂，激活DNA損傷信號傳導(dǎo)通路。轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白使LNCaP細胞發(fā)生細胞衰老。內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白和MRC5細胞衰老有關(guān)，若使MRC5過度表達轉(zhuǎn)膠蛋白，可導(dǎo)致細胞衰老。
　　 第二部分：觀察轉(zhuǎn)膠蛋白和p53之間的相互作用。
　　 目的：研究轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細胞后，p53的表達及其分布的變化，并且研究轉(zhuǎn)膠蛋白和p53之間的相互作用。
　　 方法：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細胞，在不同時間點提取全

7、細胞裂解產(chǎn)物和胞漿、胞核細胞裂解產(chǎn)物進行western blotting檢測p53表達情況，并使用轉(zhuǎn)膠蛋白和p53免疫熒光染色檢測p53分布情況。隨后，我們采用哺乳類細胞雙雜交和免疫共沉淀方法研究轉(zhuǎn)膠蛋白和p53蛋白之間的相互作用。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，Western blotting提示LNCaP細胞p53表達增加，磷酸化p53(Ser46)也相應(yīng)增加；胞漿中p53增加，而胞核中p53變化不明顯。轉(zhuǎn)膠蛋白和p53雙免疫

8、熒光染色也提示胞漿中p53水平增加。哺乳類細胞(人前列腺癌PC-3細胞)雙雜交實驗提示轉(zhuǎn)膠蛋白和p53相互結(jié)合，免疫共沉淀實驗顯示外源性、內(nèi)源性轉(zhuǎn)膠蛋白和p53分別在LNCaP細胞和BJ細胞(成纖維細胞)共沉淀。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白使LNCaP細胞p53表達增高，而且p53胞漿轉(zhuǎn)位增加。轉(zhuǎn)膠蛋白和p53在哺乳類細胞內(nèi)相互作用，并穩(wěn)定p53蛋白。轉(zhuǎn)膠蛋白和p53免疫共沉淀。
　　 第三部分：轉(zhuǎn)膠蛋白對p53下游基因及

9、內(nèi)源性凋亡途徑的影響。
　　 目的：研究轉(zhuǎn)膠蛋白對p53下游基因表達的影響，以及轉(zhuǎn)膠蛋白誘導(dǎo)LNCaP細胞凋亡的機理。
　　 方法：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至LNCaP細胞，在不同時間點收集細胞裂解產(chǎn)物，使用westernblotting檢測PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)、Bax、Bcl-2和caspase-3的表達情況，然后分別將轉(zhuǎn)膠蛋白轉(zhuǎn)染HCT116 p53-/-和p5

10、3+-+細胞株，westernblotting檢測p53下游PUMA的表達情況。最后，采用細胞計數(shù)、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶dUTP標記方法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)和流式細胞計數(shù)等方法觀察轉(zhuǎn)膠蛋白對LNCaP細胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后，LNCaP細胞促凋亡因子Bax和PUMA表達量升高，而抗凋亡因子Bcl

11、-2表達水平下降，caspase-3的表達上升。分別轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白至HCT116p53-/-和p53+/+細胞株，p53陰性細胞株P(guān)UMA無明顯變化；而p53陽性細胞株P(guān)UMA表達升高。細胞計數(shù)提示轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后細胞活力下降，TUNEL染色提示轉(zhuǎn)膠蛋白導(dǎo)致TUNEL陽性細胞數(shù)量升高，而流式細胞計數(shù)亦提示轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)膠蛋白后早期細胞凋亡增多。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)膠蛋白通過上調(diào)促凋亡因子(PUMA、Bax)及抑制抗凋亡因子Bcl-2誘導(dǎo)內(nèi)源性凋