大鼠肝臟卵圓細(xì)胞的干細(xì)胞特性和功能研究.pdf

1、背景：糖尿病(diabetes mellitus ，DM)已經(jīng)成為21 世紀(jì)嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，近年來，糖尿病的發(fā)病呈逐年上升趨勢，而且發(fā)病更趨年輕化。目前，胰腺或胰島細(xì)胞移植被認(rèn)為是一種有效根治糖尿病的方法，但是，由于胰腺供體缺乏、胰島細(xì)胞數(shù)量有限并且移植存在免疫排斥，需要終身服用免疫抑制劑，限制了其在臨床上的大量應(yīng)用。干細(xì)胞在一定條件下可轉(zhuǎn)分化為胰島細(xì)胞，成為胰島細(xì)胞潛在的替代資源。肝臟卵圓細(xì)胞(hepatic oval c

2、ells ，HOC)是存在于肝臟的一種具有自我增殖和分化潛能的干細(xì)胞，而且肝臟和胰腺在胚胎發(fā)育中均來源于內(nèi)胚層，在發(fā)生上有密切聯(lián)系，在適當(dāng)條件下還可轉(zhuǎn)分化為胰島β 細(xì)胞，將這種由自身肝臟卵圓細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的胰島β 細(xì)胞植入糖尿病患者，既可以避免免疫排斥，無需終生服用免疫抑制劑，也為新型胰島的來源開辟了途徑，為糖尿病的臨床治療提供了新思路。目前，體外卵圓細(xì)胞培養(yǎng)仍存在所得細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞的增殖活性不高，在體外傳代培養(yǎng)過程中干細(xì)胞特性保持時

3、間短，易于向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化，細(xì)胞轉(zhuǎn)分化調(diào)控機(jī)制尚不明確，轉(zhuǎn)分化條件需要摸索等問題。因此，如何實(shí)現(xiàn)在體外大量擴(kuò)增卵圓細(xì)胞并保持其干細(xì)胞的生物學(xué)特征在肝臟卵圓細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化中具有重要意義。本文通過體外細(xì)胞傳代培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞功能檢測的方法，研究肝臟卵圓細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)過程中干細(xì)胞特性的表達(dá)和保持情況并研究細(xì)胞的增殖活性以及在體內(nèi)高糖環(huán)境下細(xì)胞的功能變化。具體包括：㈠體外細(xì)胞傳代培養(yǎng)：選用2-乙酰氨基芴（2-acetaminofluore

4、ne ，2-AAF ）灌胃和四氯化碳（CCL4 ）腹腔注射的方法建立肝臟卵圓細(xì)胞活化增殖模型，用熒光激活細(xì)胞篩選法（Fluorescence-activated cell sorting ，F(xiàn)ACS ）分選細(xì)胞，對分選得到的細(xì)胞進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，并對傳代后的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和生化鑒定，目的在于研究肝臟卵圓細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)過程中干細(xì)胞特性的保持情況，為今后肝臟卵圓細(xì)胞的體內(nèi)移植和轉(zhuǎn)分化奠定良好的基礎(chǔ)；㈡體內(nèi)細(xì)胞功能檢測：采用2-AAF

5、聯(lián)合CCL4 方法建立大鼠肝臟卵圓細(xì)胞增殖活化模型，然后采用鏈脲佐菌素（streptozotocin ，STZ ）誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)高血糖環(huán)境，研究激活的肝臟卵圓細(xì)胞在自身高血糖環(huán)境下的功能，為糖尿病的干細(xì)胞治療提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)支持。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：大鼠肝臟卵圓細(xì)胞活化增殖模型的建立。
　　 目的：采用2-AAF 聯(lián)合CCL4 方法建立大鼠肝臟卵圓細(xì)胞活化增殖模型，并檢測肝臟卵圓細(xì)胞增殖表達(dá)情況。
　

6、　 方法：30 只F344 大鼠隨機(jī)分為兩組，正常對照組（NC ，n=15 ）：生理鹽水(20mg ﹒kg -1 ﹒d -1 )灌胃5 天，第6 天腹腔注射生理鹽水1.9ml ﹒kg -1 ，第7 天繼續(xù)生理鹽水灌胃，連續(xù)一周；肝臟卵圓細(xì)胞組（HOC ，n=15 ）：2-AAF(20mg ﹒kg -1 ﹒d -1 )灌胃5 天，第6 天腹腔注射四氯化碳1.9ml ﹒kg -1 (1:1 溶于玉米油中)，第7 天繼續(xù)2-AAF 灌胃，持

7、續(xù)一周。四氯化碳或者生理鹽水注射12 天后，取兩組大鼠肝臟組織，蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin ，HE ）染色，顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟組織OV-6 和Thy-1 蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：HOC 組大鼠肝臟HE 染色可見明顯的卵圓細(xì)胞增生反應(yīng),表現(xiàn)為嗜堿性卵圓形核，體積較正常肝細(xì)胞小，胞漿較少，核漿比例較大，細(xì)胞體積大小及分布不均一，多位于匯管區(qū)及小葉間膽管附近，成簇分布

8、，且逐漸向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)延伸，OV-6 和Thy-1 染色呈陽性表達(dá)；正常對照組大鼠肝臟組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，未見肝臟卵圓細(xì)胞的增殖。
　　 結(jié)論：2-AAF/CCL4 方法可成功制備肝臟卵圓細(xì)胞活化增殖模型，且具有較好的穩(wěn)定性。
　　 第二部分：大鼠肝臟卵圓細(xì)胞干細(xì)胞特性的研究。
　　 目的：研究大鼠肝臟卵圓細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中其干細(xì)胞特征的表達(dá)情況。
　　 方法：采用兩步膠原酶灌流法和流式細(xì)胞分選法分選純化卵圓

9、細(xì)胞，將分選得到的細(xì)胞置于含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增。⑴倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞傳代過程中的形態(tài)變化；⑵透射電鏡觀察傳代后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；⑶免疫細(xì)胞化學(xué)檢測傳代后細(xì)胞OV-6 、c-kit和Thy-1.1 干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)；⑷逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（reversetranscription-polymerase chain reaction ，RT-PCR ）檢測卵圓細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞標(biāo)志（c-kit ）、肝細(xì)胞標(biāo)志（HNF-4

10、α 、AFP ）和膽管細(xì)胞標(biāo)志（CK-7 、CK-19 ）的基因表達(dá)情況；⑸蛋白免疫印記（Western blotting ）檢測傳代過程中細(xì)胞內(nèi)OV-6 和AFP 蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：經(jīng)分選純化得到的肝臟卵圓細(xì)胞呈克隆樣生長，1-2 周可形成完整的細(xì)胞集落，細(xì)胞聚集在集落中心，周圍呈輻射狀生長，呈單層鋪石樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞倍增時間短，平均3-4 天需傳一代，細(xì)胞傳代培養(yǎng)可達(dá)40 天以上。①在倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞體積較小且大

11、小不均一，呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核大，傳代后細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，依然保持上皮細(xì)胞的特點(diǎn)；②在透射電鏡下觀察，可見細(xì)胞直徑約5-10 μ m ，胞核大，胞漿相對較少，核漿比例高，核仁常較明顯，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器比較少，呈現(xiàn)幼稚細(xì)胞及未分化細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)；③免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示傳代后細(xì)胞OV-6 抗體、c-kit 和Thy-1 抗體染色陽性；④RT-PCR示傳代后細(xì)胞內(nèi)可檢測到c-kit 、HNF-4 α 、AFP 、CK-7 和CK-19 基

12、因的表達(dá)；⑤Western blotting 可見傳代過程中，卵圓細(xì)胞中OV-6 蛋白持續(xù)表達(dá)，AFP 蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：大鼠肝臟卵圓細(xì)胞體外可大量擴(kuò)增培養(yǎng)并且保留其干細(xì)胞的一些生物學(xué)特性。
　　 第三部分：體內(nèi)高糖環(huán)境下肝臟卵圓細(xì)胞的功能研究。
　　 目的：通過建立肝臟卵圓細(xì)胞活化增殖模型，研究肝臟卵圓細(xì)胞在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的體內(nèi)高糖環(huán)境下的功能。
　　 方法：Wistar 大鼠21 只分為

13、肝臟卵圓細(xì)胞組（HOC ，n=7 ）、糖尿病組（DM ，n=7 ）和正常對照組（NC ，n=7 ）。HOC 組用2-AAF 聯(lián)合CCL4方法建模，成模后腹腔注射STZ （60mg/kg ）誘導(dǎo)體內(nèi)高血糖；DM 組腹腔注射STZ （60mg/kg ）建模，正常對照組。監(jiān)測三組大鼠隨機(jī)血糖；STZ處理后7 天和15 天三組大鼠行腹腔糖耐量試驗(yàn)；STZ 處理20 天后，免疫組織化學(xué)檢測三組大鼠肝臟中Insulin 的表達(dá)，RT-PCR 檢測三

14、組大鼠肝臟中胰腺內(nèi)分泌激素Insulin-1 和胰腺轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1 、Nkx6.1 的基因表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：STZ 處理后HOC 組最初血糖水平較高，15 天后開始下降，與DM 組比較P<0.05 ；腹腔糖耐量試驗(yàn)可見，HOC 組大鼠血糖調(diào)節(jié)能力明顯強(qiáng)于DM 組；RT-PCR 示HOC 組在STZ 處理前肝臟可較弱表達(dá)Nkx6.1 和Pdx-1mRNA ，不表達(dá)Insulin-1mRNA ；STZ 誘導(dǎo)的高糖下，Nkx