肝臟部分切除對(duì)肝臟干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目前,肝移植雖已成為治療終末期肝病的重要手段,但供體短缺、手術(shù)損傷、免疫排斥以及費(fèi)用高昂等問(wèn)題構(gòu)成了肝移植技術(shù)發(fā)展的主要障礙。因此,開(kāi)展具有侵入性小,并發(fā)癥少等特點(diǎn)的肝臟細(xì)胞移植(Hepatocyte transplantation,HTx)具有重要臨床意義。肝臟細(xì)胞移植分為肝細(xì)胞移植與肝臟干細(xì)胞移植。成熟肝細(xì)胞雖然具有一定再生能力,可在一定程度上重構(gòu)肝臟,但臨床實(shí)驗(yàn)中,肝細(xì)胞移植往往因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量不足或再生能力有限,而不能產(chǎn)生充分、長(zhǎng)期

2、的生物學(xué)作用。肝臟干細(xì)胞具有長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)擴(kuò)增的能力,能在體外擴(kuò)增達(dá)到臨床所需的細(xì)胞數(shù)量,且移植后在體內(nèi)也可增生。所以,肝臟干細(xì)胞移植可能在肝臟再生治療(Therapeuticliver repopulation)中發(fā)揮更重要的作用。
　　 目的:通過(guò)肝臟部分切除的方法構(gòu)建SD大鼠肝干細(xì)胞增殖模型,并檢測(cè)部分切除后存留肝臟中干細(xì)胞的增殖。
　　 方法:采用部分肝切除法建立大鼠肝葉切除模型并按切除比例分組;使用Ⅳ型膠原酶法提取

3、,分離切除部分肝臟后存留的肝臟中的細(xì)胞,貼壁后進(jìn)行體外接種培養(yǎng);培養(yǎng)過(guò)程中向RPMI1640中加入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4(fibroblast growth factor-4,FGF-4),對(duì)貼壁細(xì)胞誘導(dǎo);應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組別肝臟干細(xì)胞CD34、Thy的表達(dá);光鏡下對(duì)比觀察各組肝臟干細(xì)胞的含量和生長(zhǎng)情況;免疫熒光法鑒定各組肝臟干細(xì)胞AFP、CK18的表達(dá);

4、Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中AFP的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過(guò)切除SD大鼠不同比例的肝葉組織構(gòu)建大鼠肝葉切除的模型。
　　 2.膠原酶法提取、分離出圓形及類圓形貼壁細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)可見(jiàn)細(xì)胞呈集團(tuán)、集落樣生長(zhǎng),說(shuō)明有肝臟干細(xì)胞的增殖。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)到肝臟部分切除后第7天存留肝臟的細(xì)胞中CD34、Thy呈陽(yáng)性表達(dá),其中CD34含量為2.6％,Thy含量為1.3%;未

5、做肝臟切除的對(duì)照組肝臟細(xì)胞中CD34、Thy呈陰性表達(dá)。
　　 4.免疫熒光檢測(cè)SD大鼠肝臟切除83.4%后存留的肝臟細(xì)胞中AFP、CK18呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);肝臟切除73.1%后的存留肝臟細(xì)胞中AFP、CK18呈陽(yáng)性表達(dá);在未切除的對(duì)照組中呈陰性表達(dá)。術(shù)后第7天存留肝臟細(xì)胞中AFP、CK18星強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);術(shù)后當(dāng)天存留肝臟細(xì)胞中AFP、CK18呈陽(yáng)性表達(dá);術(shù)后第14天存留肝臟細(xì)胞中AFP、CK18呈陰性表達(dá)。肝臟部分切除后存留鼠肝灌洗

6、15分鐘后細(xì)胞中AFP、CK18呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);肝臟部分切除后存留鼠肝灌洗10分鐘后的細(xì)胞中AFP、CK18呈陽(yáng)性表達(dá);肝臟部分切除后存留鼠肝灌洗20分鐘后的細(xì)胞中AFP、CK18呈陰性表達(dá)。
　　 5.Western Blot檢測(cè)到肝部分切除后存留肝臟細(xì)胞中AFP呈陽(yáng)性表達(dá)。切除肝臟83.4%后存留肝臟細(xì)胞中AFP的表達(dá)與切除73.1%后存留肝臟細(xì)胞中AFP的表達(dá)相比較,未見(jiàn)顯著差異,P≥0.05。存留鼠肝灌洗15分鐘后的肝臟細(xì)

7、胞與存留鼠肝灌洗10分鐘后的肝臟細(xì)胞的AFP表達(dá)相比較,明顯升高,P＜0.05。術(shù)后第7天與術(shù)后當(dāng)天的存留肝臟細(xì)胞中AFP表達(dá)相比較,明顯升高,P＜0.05。
　　 結(jié)論:
　　 1.SD大鼠切除肝臟83.4%的存留肝臟含有肝臟干細(xì)胞的數(shù)量最多,切除肝臟73.1%的存留鼠肝中含有的肝臟干細(xì)胞的數(shù)量次之,未切除肝臟的鼠肝含有干細(xì)胞的數(shù)量最少。
　　 2.術(shù)后第7天存留鼠肝中肝臟干細(xì)胞的數(shù)量最多,術(shù)后當(dāng)天存留鼠肝中肝